含笑内酯对三阴性乳腺癌细胞顺铂化疗敏感性的影响及机制探讨

孟文静，谢晓娟，周立艳，贾勇圣，佟仲生

(天津医科大学肿瘤医院 国家肿瘤临床医学研究中心,天津300060)



含笑内酯对三阴性乳腺癌细胞顺铂化疗敏感性的影响及机制探讨

孟文静，谢晓娟，周立艳，贾勇圣，佟仲生

(天津医科大学肿瘤医院 国家肿瘤临床医学研究中心,天津300060)

目的 观察含笑内酯(MCL)对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞顺铂(DDP)化疗敏感性的影响，并分析其可能的机制。方法 将TNBC细胞分为MCL组、DDP组、DDP+MCL组，分别加入MCL、DDP和DDP+MCL；另设空白对照组，加入等体积培养基。培养24 h后，采用CCK8法测算细胞存活率，计算联合指数(CI)评价两药是协同(CI<0.9)或相加(CI 0.9～1.1)关系；采用流式细胞仪检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率；采用酶标仪检测细胞上清液中的谷胱甘肽。结果 MCL(2.5～10 μmol/L)、DDP(1.25～5 μmol/L)联合作用TNBC细胞时，CI<0.85；空白对照组、MCL组、DDP组、MCL+DDP组细胞凋亡率分别为4.3%±1.3%、7.6%±2.0%、13.4%±4.3%、37.0%±5.7%，MCL+DDP组细胞凋亡率明显高于其他3组(P均<0.01)。空白对照组、MCL组、DDP组、MCL+DDP组细胞上清液中谷胱甘肽水平分别为(43.54±3.71)、(35.85±2.67)、(50.33+3.16)、(38.46±1.74)mmol/mg，MCL组、MCL+DDP组﹤空白对照组﹤DDP组，P均<0.05；MCL组、MCL+DDP组比较，P>0.05。结论 MCL可通过降低细胞内谷胱甘肽水平，从而增强TNBC细胞对DDP的敏感性。

三阴性乳腺癌；含笑内酯；顺铂；耐药

乳腺癌是一种高度异质性疾病，不同分子分型乳腺癌的治疗和预后差异较大。三阴性乳腺癌(TNBC)是指一类雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2(HER-2)表达均阴性的乳腺癌，其侵袭性强，预后较差，缺乏分子靶点，内分泌治疗及抗HER-2靶向治疗均无效。目前，顺铂(DDP)是治疗TNBC的主要化疗药物，但可导致肿瘤细胞内谷胱甘肽水平升高从而降低药物敏感性，增加耐药的概率。因此，如何提高TNBC对DDP的敏感性成为研究热点之一。含笑内酯(MCL)是从70多种药物中筛选出的一种小分子化合物，其主要成分为倍半萜内酯，可以用小白菊内酯(PTL)为原料，在一定溶剂和温度下反应得到。因MCL衍生于PTL，故其活性与PTL相当，但稳定性更高，血浆半衰期为PTL的6倍，并且成本较低[1，2]。2015年1～3月，我们观察了DDP联合MCL对TNBC细胞增殖、凋亡及谷胱甘肽水平的影响，探讨MCL增强TNBC细胞对DDP敏感性的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231，来源于天津医科大学肿瘤医院乳腺癌重点实验室；DDP购自美国Sigma公司；MCL由天津尚德药缘科技股份有限公司合成，分子式为C15H20O3，配置时用二甲基亚砜(DMSO)溶解；CCK-8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所，细胞凋亡检测试剂盒购自BD生物科技公司，谷胱甘肽检测试剂盒、RIPA裂解液及ECL发光液购自北京碧云天生物技术公司。

1.2 细胞培养 MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养；每3～4日传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 MCL对DDP化疗作用的影响观察 取对数生长期细胞，按1×104/孔接种96孔板，37 ℃过夜。将细胞随机分为3组，MCL组给予0、2.5、5、10、20、40 μmol/L 的MCL，DDP组给予0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的DDP，MCL+DDP组别以MCL、DDP各自相应的倍比浓度；每个浓度设3复孔，37 ℃培养24 h。弃上清，更换含10%体积分数CCK-8的完全培养基，37 ℃继续培养4 h。采用自动酶标仪(Bio-Rad)检测各孔490 nm波长的光密度(OD)值，计算MCL、DDP对MDA-MB-231细胞增殖的IC50值。依据中效原理(Chou-Talalay联合指数法)为基础，应用Combidrug统计软件计算联合指数(CI)，并评价两药是协同(CI<0.9)或相加(CI 0.9～1.1)关系。

1.4 细胞凋亡观察 取对数生长期细胞，按1×105/孔接种于6孔板，37 ℃过夜。将细胞分为空白对照组(加入等体积培养基)、MCL组、DDP组、DDP+MCL组，每组设3个复孔，分别加入MCL 5 μmol/L、DDP 5 μmol/L、DDP 5 μmol/L+MCL 5 μmol/L。37 ℃培养24 h后，胰酶消化；收集细胞，离心，PBS冲洗；分别加入缓冲液50 μL、AnnexinⅤ-FITC 5 μL、PI染液10 μL，上流式细胞仪检测凋亡细胞。实验重复3次，计算细胞凋亡率。

1.5 细胞上清液谷胱甘肽检测 取对数生长期细胞，以1×105/孔接种于6孔板，细胞分组及药物处理同1.4。37 ℃培养24 h后，PBS洗涤，胰酶消化；离心收集细胞，弃上清；加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂S溶液，充分震荡后用液氮和37 ℃水浴对样品进行两次快速冻融。冰浴放置5 min后，离心取上清液。用蛋白去除试剂稀释5倍后，将标准品和样品各10 μL分别加入96 孔板中；加入总谷胱甘肽检测工作液150 μL，25 ℃孵育5 min；加入0.16 mg/mL NADPH 50 μL，水平振荡混匀25 min后用酶标仪测定A412值，然后对照标准曲线计算谷胱甘肽水平。实验重复3次。

2 结果

2.1 MCL对DDP化疗作用的影响 MCL组的IC50为(38.15±2.45)μmol/L，DDP组的IC50为(20.36±2.64)μmol/L，MCL+DDP组MCL的IC50为(29.12±1.85)μmol/L、DDP的IC50为(8.12±2.71)μmol/L，MCL+DDP组DDP的IC50较DDP组明显降低(P<0.05)。较低浓度DDP(1.25～5 μmol/L)、MCL(2.5～10 μmol/L)联合作用细胞时呈协同作用(CI<0.85)，随着药物浓度的增加两药联合趋于相加(CI>1.05)。

2.2 各组细胞凋亡率比较 空白对照组、MCL组、DDP组、MCL+DDP组细胞凋亡率分别为4.3%±1.3%、7.6%±2.0%、13.4%±4.3%、37.0%±5.7%，MCL+DDP组细胞凋亡率明显高于其他三组(P均<0.01)。

2.3 各组细胞上清液谷胱甘肽水平比较 空白对照组、MCL组、DDP组、MCL+DDP组细胞上清液中谷胱甘肽水平分别为(43.54±3.71)、(35.85±2.67)、(50.33+3.16)、(38.46±1.74)mmol/mg，MCL组、MCL+DDP组﹤空白对照组﹤DDP组，P均<0.05；MCL组、MCL+DDP组比较，P﹥0.05。

3 讨论

目前，DDP是治疗TNBC最常用的化疗药物之一，但乳腺癌细胞对DDP的耐药作用是影响化疗效果的主要原因之一。DDP是一种细胞毒性铂类衍生物，肿瘤细胞对其耐药机制主要包括细胞内DDP累积量减少、谷胱甘肽和巯基蛋白水平升高、DNA损伤修复[3～6]。因此，寻找能逆转肿瘤细胞对DDP耐药的方法成为目前研究的热点。

PTL是从菊科植物中提取的倍半萜烯酯，可诱导乳腺癌、结肠癌及肝癌等肿瘤细胞凋亡，也可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[7～9]。但PTL稳定性差、血浆半衰期短，限制了其临床应用。MCL是PTL的衍生物，其活性与PTL相当，但在血浆中更加稳定，血浆半衰期也较长。本研究显示，MCL和DDP单独及联合作用于TNBC细胞株MDA-MB-231时均能抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。当两种药物联合使用时，对细胞的抑制作用及凋亡诱导作用明显强于两药单独使用，具有良好的协同作用。

细胞内谷胱甘肽水平提高是肿瘤细胞对DDP敏感性降低的主要机制之一。本研究同样发现，加入DDP后TNBC细胞内谷胱甘肽水平明显升高。谷胱甘肽通过巯基与肿瘤细胞内的自由基结合，可以转化成容易代谢的酸类物质从而加速自由基的排泄，有助于降低DDP疗效，进而使肿瘤细胞对DDP耐药。谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸缩合而成的含有γ-酰胺键和巯基的三肽，其体内存在形式有氧化型(GSSH)和还原型(GSH)两种。GSH能够帮助机体保持正常的免疫系统功能，具有抗氧化作用和整合解毒的作用，在多种肿瘤细胞中GSH水平升高，与肿瘤细胞对抗癌药物的抵抗有关，尤其是对铂类的耐药。谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶(GCL)的基因表达是控制GSH合成、维持细胞内GSH含量稳定的重要途径。GCL是由一个73 kD的催化亚基(GCLC) 和一个31 kD的调节亚基(GCLM)所组成的异二聚体，GCLC具有催化活性并且是GSH反馈抑制的位点[10]。另外，谷胱甘肽过氧化酶1(GPX1)同样在GSH合成过程中发挥重要作用。

PTL可以通过抑制谷胱甘肽合成通路的关键酶GCLC及GPX1而干扰谷胱甘肽的合成，亦可通过活化NADPH氧化酶产生活性氧，耗竭细胞内的谷胱甘肽和蛋白巯基，从而使细胞死亡，达到抗肿瘤作用[11～13]。而MCL作为PTL的衍生物，是否二者在诱导肿瘤细胞凋亡方面存在共同作用机制，是否MCL亦可通过抑制谷胱甘肽发挥其化疗增敏作用，是本实验的研究重点。本研究结果显示，MCL可以明显降低TNBC细胞内谷胱甘肽水平，与DDP联用时，有效增强TNBC对DDP的敏感性。推测PTL作为MCL的类似物，可以抑制肿瘤细胞内谷胱甘肽合成通路的关键酶GCLC及GPX1的蛋白表达，从而降低细胞内谷胱甘肽水平。

综上所述，MCL可通过下调细胞内谷胱甘肽水平，抑制谷胱甘肽对DDP的解毒作用，从而增加TNBC细胞对DDP的敏感性。但是，MCL与DDP协同抗肿瘤的机制很复杂，可能还通过其他途径引起肿瘤细胞凋亡，尚需进一步研究。

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Effect of Micheliolide on chemosensitivity of triple negative breast cancer cells to cisplatin

MENGWenjing,XIEXiaojuan,ZHOULiyan,JIAYongsheng,TONGZhongsheng

(TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterforCancer,Tianjin300060,China)

Objective To observe the effect of Micheliolide (MCL) on chemosensitivity of triple negative breast cancer (TNBC) cells to cisplatin (DDP) and the related mechanisms. Methods TNBC cells were randomly divided into MCL group, DDP group and DDP+MCL group, which were respectively added with MCL, DDP and DDP+MCL. Another blank control group was added with equal volume of culture medium. The cell viability was measured by CCK8, the CI was calculated, apoptotic cells were calculated by flow cytometry as well as the apoptosis rate, and glutathione (GSH) in supernatant was detected by ELISA.Results MCL(1-10 μmol/L) combined with DDP (1-5 μmol/L)showed an obvious synergistic effect(CI<0.85), the apoptosis rates were 4.3%±1.33%, 7.6%±2.02%, 13.4%±4.26% and 37.0%±5.74% in the control, MCL, DDP and MCL+DDP groups, respectively; the apoptosis rate of the MCL+DDP group was higher than that of the MCL group and DDP group (allP<0.05). The intracellular GSH levels were (43.54±3.71), (35.85±2.67), (50.33+3.16), and (38.46±1.74) mmol/mg in the control, MCL, DDP and MCL+DDP groups, respectively. The intracellular GSH level: MCL group, MCL+DDP group0.05.Conclusion MCL enhances the sensitivity of TNBC cells MDA-MB-231 to cisplatin by decreasing intracellular GSH levels.

triple negative breast carcinoma; micheliolide; cisplatin; drug resistance

教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20131202120003)；天津市抗癌重大专项攻关计划(12ZCDZSY16200)。

孟文静(1982-)，女，医师，主要研究方向为乳腺癌的综合治疗及基础。E-mail: wenjingmx@163.com

简介：佟仲生(1963-)，男，主任医师，主要研究方向为乳腺癌的综合治疗及基础。E-mail: tongzhongsheng@tjmuch.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.004

R737.9

A

1002-266X(2016)42-0014-03

2016-01-17-21)