食管癌变进程中HGF、c-met、VEGF蛋白的表达变化及意义

徐志彬，冯军波，袁丽，郑秀丽，王士杰，吴明利

(1河北医科大学第四医院，石家庄050011; 2 宁晋县妇幼保健院)



食管癌变进程中HGF、c-met、VEGF蛋白的表达变化及意义

徐志彬1，冯军波2，袁丽1，郑秀丽1，王士杰1，吴明利1

(1河北医科大学第四医院，石家庄050011; 2 宁晋县妇幼保健院)

摘要：目的研究从正常食管→食管癌前病变→早期食管癌→进展期食管癌过程中，处于不同病变阶段上皮或间质中HGF、c-met及VEGF蛋白的表达变化及意义。方法 免疫组化法检测HGF、c-met及VEGF蛋白在正常食管组织20份、低级别上皮内瘤变组织30份、高级别上皮内瘤变组织50份、早期癌组织25份、进展期癌组织25份中的表达。抗体CD34标记血管内皮细胞，测算微血管密度。结果正常食管低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期癌变、早期癌、进展期癌上皮组织中，HGF蛋白阳性表达率依次为0(0/20)、3%(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、60%(15/25)；在间质中的阳性表达率依次为0(0/20)、0%(0/30)、30%(15/50)、52%(13/25)、76%(19/25)；在食管病变上皮中c-met蛋白阳性表达率依次为0(0/20)、10%(3/30)、30%(15/50)、36%(9/25)、56%(14/25)；在间质中VEGF蛋白阳性表达率依次为0(0/20)、3%(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、52%(13/25)；MVD值分别为12.33±1.68、15.72±1.97、20.91±2.20、26.42±1.96、30.01±2.35。5种组织中，HGF、c-met、VEGF蛋白的表达及MVD值差异有统计学意义(P均<0.01)。结论 随食管癌变进展，食管上皮组织中HGF、c-met及间质中VEGF蛋白表达均明显升高，HGF/c-met蛋白通路可刺激间质成纤维细胞分泌VEGF蛋白，促进间质微血管形成，加速癌的进展。

关键词：食管肿瘤；癌相关纤维母细胞；肝细胞生长因子；c-met；血管内皮生长因子

肝细胞生长因子(HGF)主要由活化的间质成纤维细胞(常以α-SMA+为标志)分泌，它的生物学活性是由原癌基因c-met编码的受体蛋白介导实现的[1]。已证实HGF/c-met通路与肿瘤的生长和浸润转移密切相关[2~4]。HGF、c-met蛋白在食管癌组织中的表达已有报道，且被发现与患者的预后密切相关，但在食管癌变动态进程中，尤其是在癌前病变阶段，该通路与食管病变相关性的研究尚未见报道，且它们与VEGF蛋白的共同表达是否可促进肿瘤的血管形成仍未有定论。本文进行了相关探讨。现报告如下。

1资料与方法

1.1 临床资料选取本院2006年1月～2012年12月行内镜黏膜切除术后所得的150例食管癌前病变及食管早期癌患者标本，男84例、女66例，年龄48～76岁。入选标本中低级别上皮内瘤变30份(低级别上皮内瘤变组)、高级别上皮内瘤变50份(高级别上皮内瘤变组)、早期癌25份(早期癌组)。同时随机选取2011年1~12月食管进展期癌患者的组织蜡块25份(进展期癌组)，患者男13例、女12例，年龄56~76岁；贲门癌患者手术治疗后的阴性上残正常食管组织20份(正常组)，患者男9例、女11例，年龄56~66岁。各组患者年龄、性别均衡可比。

1.2组织HGF、c-met及VEGF蛋白的检测采用免疫组织化学一步法。用已知阳性的人癌组织切片作阳性对照；以PBS液代替一抗作阴性对照。α-SMA鼠抗人单克隆抗体和CD34鼠抗人单克隆抗体由北京西雅金桥生物技术有限公司提供；HGF兔多抗IgG、c-met兔单克隆抗体、VEGF兔多克隆抗体，由美国Bioworldtechnology公司提供。

判断标准：按照王立峰等[5]的标准，以间质成纤维细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，观察5个具有代表性的高倍视野(×400)，根据阳性范围：无明显阳性细胞为-，局灶阳性者判定为+，弥漫阳性者判定为++，为便于统计，将+和++合并为阳性。上皮中细胞质及细胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，在染色均匀的区域，选取5个高倍镜视野(×400)，根据阳性细胞所占百分比，<1/3为阴性表达，≥1/3为阳性表达。

1.3微血管密度(MVD)值的测算 参照Maeda等[6]的方法，先在100倍视野下观察CD34阳性染色的微血管高密度区，即热点区，在400倍视野下观察，凡与周围细胞和结缔组织成分有明显区别的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个微血管；管腔直径>8个红细胞或肌层较厚的血管均不计数。记录3个高倍视野下的微血管数值，取平均值作为每例的MVD值。

2结果

2.1各组α-SMA蛋白的表达α-SMA在正常食管组织成纤维细胞基本无表达(0/20)，仅在平滑肌细胞和血管平滑肌细胞中表达；低级别上皮内瘤变组、高级别上皮内瘤变组、早期癌组、进展期癌组间质中α-SMA阳性表达率分别为10%(3/30)、36%(18/50)、60%(15/25)、92%(23/25)；阳性细胞呈梭形或条带样，主要存在于癌前病变或癌巢周围间质中，在进展期癌时密集呈条索状包裹着癌巢。各组α-SMA阳性表达率差异有统计学意义，与正常组比较，低级别上皮内瘤变无统计学差异，高级别上皮内瘤变、早期癌及进展期癌组差异均有统计学意义(P均<0.01)。

2.2各组HGF蛋白的表达HGF蛋白表达主要定位于上皮基底层细胞及异型细胞、癌细胞及癌旁纤维母细胞，胞质着色。正常组、低级别上皮内瘤变组、高级别上皮内瘤变组、早期癌组、进展期癌组上皮HGF阳性表达率分别为0(0/20)、3(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、60%(15/25)。正常组、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变组、早期癌组、进展期癌组间质中HGF阳性表达率分别为0(0/20)、0(0/30)、30%(15/50)、52%(13/25)、76%(19/25)。组间比较差异统计学意义(间质χ2=36.44，上皮χ2=31.81，P均<0.01)。

2.3各组c-met蛋白的表达 c-met蛋白只表达于上皮，正常、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期癌、进展期癌组上皮中，c-met阳性表达率分别为0(0/20)、10%(3/30)、30%(15/50)、36%(9/25)、56%(14/25)。组间比较差异有统计学意义(χ2=23.52.81，P<0.01)。

2.4各组VEGF蛋白的表达VEGF在间质成纤维细胞的表达定位于细胞质，正常食管为阴性表达，在低级别上皮内瘤变组、高级别上皮内瘤变组、早期癌组、进展期癌组VEGF阳性表达率分别为3%(1/30)、26%(13/50)、36%(9/25)、52%(13/25)，组间比较差异有统计学意义(χ2=20.17，P<0.01)。

2.5各组微血管密度MVD比较正常食管和低级别上皮内瘤变组织中血管少，形态规则，而进展期癌血管明显增高，管腔大小不一，分布杂乱。正常组、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期癌、进展期癌组MVD值分别为12.33±1.68、15.72±1.97、20.91±2.20、26.42±1.96、30.01±2.35，组间比较，F=251.327，P=0.000。

3讨论

肿瘤由实质和间质构成，间质微环境在肿瘤的发生、发展中所起的重要作用已被大家熟知，微环境中主要的细胞成分——癌相关纤维母细胞(CAFs)对于促进上皮细胞的恶性转变起至关重要作用。CAFs是活化的间质纤维母细胞，α-SMA阳性表型是其活化标志之一。CAFs功能复杂，可分泌多种金属蛋白酶降解基质，促进癌细胞的迁徙；分泌多种生长因子，促进上皮细胞增殖。HGF是活化的CAFs能够大量分泌表达的一类非常重要的生长因子，它可以促进上皮细胞分裂和生长，兼具促血管生成作用。c-met是由原癌基因编码的蛋白产物，具有酪氨酸激酶活性，广泛分布于上皮细胞膜表面，是HGF的单一受体。研究表明，HGF和c-met在多种恶性肿瘤中常共同过度表达，二者可构成异常自分泌环，持续激活信号通路，从而促进肿瘤的侵袭和生长。HGF还可通过PI3K途径诱导VEGF的表达和分泌，后者具有强大的促肿瘤血管生成作用。

本研究显示，在正常食管组织中，间质成纤维细胞的α-SMA表型为阴性，在从低级别上皮内瘤变→高级别上皮内瘤变→早期癌→进展期癌转变过程中，间质成纤维细胞的α-SMA阳性表达率逐渐升高，进展期癌组织中则可见大量的CAFs，主要分布于癌团边缘，呈团、片状，或呈条带状包裹着癌巢。上述结果提示：食管癌变进程中，伴随着上皮细胞的恶变，间质成纤维细胞也在逐步发生活化，在逐渐向CAFs转化的同时，其数量明显增加，说明此类细胞可能参与了食管鳞状上皮细胞的恶性转变。本研究还发现，随病变进展，癌变各阶段间质成纤维细胞高表达HGF，提示其可能通过旁分泌途径参与上皮细胞的恶性转化；同时发现，癌变各阶段上皮细胞也联合高表达HGF和c-met蛋白，由此推测，活化的间质成纤维细胞通过旁分泌HGF而与上皮细胞表面的c-met结合，使细胞外刺激由细胞表面传入，启动了胞质中的信号转导通路，通过多种途径将信号传递到上皮细胞核内，促进上皮细胞自分泌HGF，这种HGF再与上皮细胞自身的受体c-met结合形成自分泌环，促进肿瘤细胞自身的增殖，间质细胞来源的HGF很可能在这一过程中是一个重要的始动因素。

肿瘤的快速生长离不开丰富的血管供氧和养分。HGF是血管生成诱导剂，受到HGF活化的c-met受体可诱导骨髓内皮祖细胞向血管内皮细胞分化，刺激内皮细胞增殖和迁移。臧茹琨等研究发现，HGF阳性的食管癌组织MVD值较HGF阴性的癌组织MVD值高，且高MVD组HGF阳性率明显高于低MVD组。VEGF是促血管生长因子，能直接刺激血管内皮细胞分裂、增殖，诱导肿瘤血管生成。研究显示，HGF能够直接或间接促进VEGF分泌表达，并且二者具有协同作用。本实验结果显示，随食管癌变进展，食管间质成纤维细胞逐步发生活化，其表达HGF和VEGF蛋白均逐渐增高，MVD值亦逐渐增高，尤其在高级别上皮内瘤变阶段，其增高尤为明显，提示此两种蛋白的共同分泌表达、协同作用能明显促进间质的微血管生成。

在食管癌变进程中，伴随着上皮细胞的恶性变，间质成纤维细胞逐渐发生了活化，功能异常活跃，间质成纤维细胞和上皮细胞表达HGF蛋白均逐渐升高，与之相似，上皮细胞表达c-met也逐渐升高，可见，随着食管恶变，间质成纤维细胞可以旁分泌HGF蛋白，与c-met蛋白结合而促进上皮细胞的转化和增殖，同时可间接刺激VEGF蛋白的表达，HGF与VEGF蛋白的共同表达对于促进食管病变间质微血管生成起重要作用，作为核心环节， 阻断HGF/c-met通路有可能成为食管癌阻断治疗突破点。

参考文献：

[1] Zeng Q, Chen S, You Z, et al. Hepatocyte growth factor inhibits anoikis in head and neck squamous cell carcinoma cells by activation of ERK and Akt signaling independent of NFkappa B[J]. J Biol Chem, 2002,277(28):25203-25208.

[2] 张彦升,刘少华,魏奉才,等.肝细胞生长因子及其受体在口腔鳞癌和颈淋巴结中的表达[J].山东大学学报(医学版),2008,46(4):420-423.

[3] 陈俊忠,赵勇,徐嘉凤,等.肝细胞生长因子及其受体在胃癌组织中的表达[J].南方医科大学学报,2007,27(11):1771-1773.

[4] 韩世愈,贾爽,贾长茹,等.肝细胞生长因子及C-Met的表达与宫颈癌浸润和转移的关系[J].中国肿瘤临床,2006,33(21):1214-1216.

[5] 王立峰,王瑞芬,郝兆星,等.胃癌中肿瘤相关纤维母细胞蛋白表达改变及意义[J].世界华人消化杂志,2007,15(20):2263-2267.

[6] Maeda K, Chung YS, Ogawa Y, et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma[J]. Cancer, 1996,77(5):858-863.

Changes in levels of HGF, c-met and VEGF expression in esophageal carcinogenesis

XUZhibin1,FENGJunpo,YUANLi,ZHENGXiuli,WANGShijie,WUMingli

(1FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression changes in levels of HGF, c-met and VEGF of fibroblasts in different esophageal lesions from normal to precancerous lesion, then to early carcinoma and advanced carcinoma. Methods Immunohistochemistry was uesd to detect the protein expression of HGF, c-met and VEGF in 20 cases of normal tissues, 30 cases of low-grade intraepithelial neoplasia (LGIEN), 50 cases of high-grade intraepithelial neoplasia (HGIEN), 25 cases of carcinoma tissues in the early stage (CIS) and 25 cases of carcinoma tissues in the progressive stage (EA), respectively. Antibody CD34 marker was used to mark vascular endothelial cells for microvascular density detection. ResultsAs the esophageal carcinogenesis progressed, the positive expression rates of HGF protein in the esophageal epithelia were 0%(0/20), 3.33%(1/30), 26%(13/50), 36%(9/25) and 60%(15/25), respectively. The positive expression rates of HGF protein in esophageal stromal fibroblasts were 0%(0/20), 0%(0/30), 30%(15/50), 52%(13/25) and 76%(19/25). The positive expression rates of c-met protein in the esophageal epithelia were (0/20), 10%(3/30), 30%(15/50), 36%(9/25) and 56%(14/25). The positive expression rates of VEGF protein were 0(0/20), 3.3% (1/30), 26%(13/50), 36%(9/25) and 52%(13/25). Significant difference was found in the positive expression of HGF, c-met and VEGF among five kinds of tissues (χ2=36.44, 31.81, 23.52 and 20.17, respetively; all P <0.05).ConclusionsAs esophageal carcinogenesis progresses, the expression of HGF and c-met in the esophageal epithelial tissues and VEGF protein in the stromal fibroblasts is significantly increased. HGF/c-met protein pathway can stimulate interstitial fibroblasts to secrete and express VEGF protein, promote the formation of interstitial capillaries and speed up the progress of cancer.

Key words:esophageal neoplasms; cancer-associated fibroblasts; hepatocyte growth factor; c-met; wascular endothelial growth factor

(收稿日期：2015-09-11)

中图分类号：R735.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)01-0009-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.003

通信作者简介：吴明利(1964-)，男，主任医师，主要从事食管癌早诊早治研究。E-mail：wu.ml@tom.com

作者简介：第一徐志彬(1976-)，男，副主任医师，主要从事食管癌早诊早治研究。E-mail：xzblxh@sina.com

基金项目：河北省卫生厅医学科学研究重点课题计划项目(20150749)。