Cereblon在多发性骨髓瘤中的研究进展及临床意义

赵永峰，王　仙

荆州市第一人民医院血液科，湖北 荆州 434000



*通信作者

Cereblon在多发性骨髓瘤中的研究进展及临床意义

赵永峰，王仙*

荆州市第一人民医院血液科，湖北 荆州 434000

[摘要]以沙利度胺、来那度胺、泊马度胺为代表的免疫调节药物，对于多发性骨髓瘤患者的治疗反应率及预后产生了重要影响。Cereblon(CRBN)，最初发现与常染色体隐性遗传非综合征性智力发育迟缓相关，近年研究已经证明其不仅为沙利度胺致畸作用的靶点，还与免疫调节药物抗骨髓瘤作用的临床反应率及患者的生存时间相关；目前认为，CRBN可能是通过形成DDB1-CUL4-ROC1泛素连接酶复合物介导抗骨髓瘤活性。还需要更多有关CRBN分子机制及临床相关性研究以促进免疫调节药物耐药机制的进一步发展以及更有效、低毒性的药物出现，提高多发性骨髓瘤患者的生存质量。

[关键词]多发性骨髓瘤；免疫调节药物；Cereblon

0引言

多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一种恶性浆细胞肿瘤，以贫血、肾功能损害、反复感染、溶骨性骨破坏等为临床表现，多发生于中、老年人。免疫调节药物是多发性骨髓瘤治疗方案中的重要基石，其对患者临床缓解率的提高以及生存期的延长产生了重要影响。

Cereblon(CRBN)作为沙利度胺致畸作用的主要分子靶标而被发现，其对探讨免疫调节药物在多发性骨髓瘤中的作用机制具有重要意义，且近年来多数研究报道其与多发性骨髓瘤患者的反应率和生存期相关。为了解CRBN与多发性骨髓瘤的临床相关性以及可能的作用机制，笔者对其在多发性骨髓瘤中的相关研究作简要综述。

1CRBN与免疫调节药物的发现

1.1CRBN的发现CRBN基因位于3p染色体，作为轻型智力发育迟缓家族中编码ATP依赖的Lon蛋白酶的基因而首次被发现[1]。广泛分布于不同的组织，尤其是在脑组织中存在高水平表达，通过对脑组织裂解物的免疫沉淀，发现其可与大电导钙离子激活钾通道(Large-conductance calcium-activated potassium channel，BKCa)α亚单位细胞溶质内的羧基末端直接相互作用，干扰该通道四聚体的组装及细胞表面表达；此外,CRBN的Lon结构域可与视网膜电压门控性氯离子通道(ClC-2)羧基端的远侧区相互作用[2-3]。Ito等[4]通过使用高性能的磁珠以及亲和纯化的方法，发现沙利度胺与CRBN蛋白结合，作为Cul4-DDB1 E3泛素连接酶复合物的底物受体发挥功能，第一次证明了CRBN可能为沙利度胺致畸作用的重要靶点,该发现对于沙利度胺作用机制的研究具有里程碑式的意义。

1.2三代免疫调节药物的发现沙利度胺为第一代免疫调节药物，其用药史经历了多重转变：于上世纪50年代合成，在欧洲和加拿大，因为其帮助睡眠及镇吐作用作为非处方药而广泛应用；1961年德国“海豹肢症”生长缺陷婴儿数量的增加，使其撤出市场；几年之后，发现其可用于麻风病的治疗，于1998年在美国再次被应用于临床；1999年，Singhal等[5]首次将沙利度胺作为单药用于治疗难治性多发性骨髓瘤患者,显示了较好的临床有效性；随后进行了大量关于沙利度胺单药或联合地塞米松治疗难治或复发性多发性骨髓瘤的临床试验。沙利度胺随后被来那度胺取代，来那度胺为一个毒性较低但活性较高的衍生物，2006年被FDA批准与地塞米松联合用于治疗复发或难治性多发性骨髓瘤。2013年，第三代免疫调节药物泊马度胺被批准用于经包括来那度胺及硼替佐米至少两种药物治疗在内的复发/难治性多发性骨髓瘤患者。

2免疫调节药物治疗多发性骨髓瘤的相关研究

1999年，Singhal等[5]首次将沙利度胺用于治疗多发性骨髓瘤，给药剂量为200～800 mg/d，中位给药天数为80 d，经治疗的总反应率为32%，随后进行了许多关于沙利度胺治疗难治或复发多发性骨髓瘤的临床试验[6-7]。2006年美国FDA批准比沙利度胺活性强的衍生物-来那度胺用于多发性骨髓瘤的治疗；无论单用来那度胺，还是与其他药物联合，对复发或难治性多发性骨髓瘤均具有较好的临床反应性，且无进展生存时间延长，不良反应主要是粒细胞减少、血小板减少及静脉血栓形成等[8-9]。2013年2月被FDA批准的治疗多发性骨髓瘤的新药泊马度胺，适用于在来那度胺或硼替佐米治疗过程中或者末次治疗结束的60 d内病情进展的多发性骨髓瘤患者。Ⅰ～Ⅲ期临床，临床反应率及生存时间令人欣慰[10-12]，尤其是Ⅱ、Ⅲ期泊马度胺联合地塞米松的多中心临床研究结果显示：泊马度胺联合低剂量地塞米松治疗组无论与泊马度胺单药治疗相比，还是与高剂量地塞米松单药治疗相比，中位无进展生存时间均延长，差异有统计学意义。泊马度胺联合低剂量地塞米松的治疗方案可作为复发或难治性多发性骨髓瘤患者的新选择。

3CRBN在多发性骨髓瘤中的临床意义

3.1CRBN及相关蛋白对于免疫调节药物活性的必要性免疫调节药物改善了多发性骨髓瘤患者的预后，但是其作用机制一直尚未阐明。近年来，CRBN的发现，为理解该类药物的作用机制奠定了重要基础，多项研究证明，CRBN为该类药物发挥作用的重要条件，似乎可以称其为免疫调节药物结合分子，可能与其抗骨髓瘤活性以及药物耐药相关。

Zhu等[13]首次将多发性骨髓瘤与CRBN的表达联系起来，通过利用预先设计的CRBN shRNA慢病毒表达载体感染人类多发性骨髓瘤细胞系，发现感染后的细胞CRBN表达明显降低，细胞活性降低65%～78%；检测0～30%的感染后存活细胞在抗骨髓瘤药物存在条件下的生长情况，发现CRBN缺失可以诱导细胞对抗骨髓瘤药物的耐药，但是并没有对不相关的药物如硼替佐米、地塞米松以及美法仑发生耐药。进一步通过shRNA进行CRBN基因敲除，可诱导多发性骨髓瘤细胞系IRF4基因及蛋白表达水平的下调，提示CRBN的下游分子靶标可能包括了干扰素调节因子4(Interferon regulatory factor 4，IRF4)。IRF4在成熟的浆细胞上大量表达，并且在B细胞的分化过程中发挥重要作用，与骨髓瘤患者的生存率相关[14]。

上述有关CRBN对于免疫调节药物抗骨髓瘤活性的重要性及其表达水平与药物耐药的相关性在Lopez-Girona等[15]的研究中同样得到了证实：shRNA可以诱导U266细胞系CRBN表达水平的降低，这些低水平表达CRBN的细胞对来那度胺的敏感性低；来那度胺耐药的细胞系H929细胞系同样存在CRBN水平的降低，泊马度胺及来那度胺均耐药的细胞系DF15R中，CRBN水平无法检测。上述几项研究证明，CRBN可能为直接与来那度胺及泊马度胺治疗意义相关的分子靶标，且研究者对下游分子通路进行了初步探讨，CRBN可能通过形成CRBN-DDB1-CUL4复合物而介导其抗骨髓瘤活性。

3.2CRBN与多发性骨髓瘤患者临床反应率及生存时间的相关性Heintel等[16]通过对使用来那度胺及地塞米松治疗的49份新诊断多发性骨髓瘤患者的骨髓样本通过实时聚合酶链反应行CRBN表达的检测：正常骨髓组织的CRBN表达设置为1；发生完全反应CR的患者中位CRBN表达值确定为3.45；非常好的部分反应VGPR、部分反应PR、疾病稳定SD以及疾病进展PD的中位CRBN表达分别为3.75、2.01、0.78、0.70，即未发生反应患者的CRBN表达水平低于正常骨髓组织。此外，反应患者与非反应患者相比，CRBN表达水平与来那度胺治疗的反应性显著相关(r=0.48，P<0.001)；在明确的预后参数中，只有β2微球蛋白与CRBN表达显著相关(r=0.66，P<0.001)；CRBN表达与IRF4(r=0.57，P<0.001)、CTNNB1(r=0.7，P<0.001)存在比较紧密的联系；Cox回归分析并没有发现与无进展生存时间及总生存时间的相关性。

总之，该研究证明CRBN表达与来那度胺治疗的多发性骨髓瘤患者的临床反应性具有统计学意义的相关性。

Broyl等[17]研究者对参加HOVON-65/GMMG-HD4临床试验的新诊断多发性骨髓瘤患者进行CRBN基因检测分析，并对其与患者的临床反应率及生存时间进行相关性研究：单变量Cox回归分析表明，CRBN基因表达与无进展生存时间(P=0.005)及总生存时间(P=0.04)显著相关；使用Kaplan-Meier进一步分析表明，CRBN表达在中位数以上与中位数以下相比较，存在较长的无进展生存时间(P=0.009)；多变量Cox回归分析表明，较高的CRBN表达水平与较长的无进展生存时间显著相关，与总生存时间无此相关性；但该研究并没有发现CRBN表达水平与临床反应率改善之间的相关性。

另外的一项研究不仅肯定了CRBN表达水平与临床反应率之间的相关性，同时证明其可能与患者的生存时间相关：77例接受免疫调节药物联合地塞米松治疗的患者中有14例患者存在CRBN中位表达<0.8,而这些患者中没有一例对治疗发生反应；CRBN表达0.8～0.9患者的反应率为40%；CRBN表达>0.9患者的反应率为49%；中位CRBN表达≥0.889与<0.889患者之间的无进展生存时间(3.0个月vs.8.9个月,P=0.000 6)及总生存时间(9.1个月vs.27.2个月,P=0.01)之间差异具有统计学意义，但是在多药联合化疗组尚未发现此相关性[18]。

3.3CRBN在多发性骨髓瘤中相关分子机制的研究泛素化修饰在肿瘤的发生发展中具有重要作用，其中E3泛素连接酶Cullin4A( CUL4A)能够通过与DDB1相结合而泛素化多种底物，介导其降解，这种酶通过调节DNA的修复、复制和转录，从而在肿瘤的发生过程中发挥关键作用。多数有关CRBN与多发性骨髓瘤的相关性研究证明了CRBN通过结合DDB1-CUL4-ROC1，形成泛素连接酶多蛋白复合物而介导免疫调节药物发挥抗骨髓瘤活性，并且对该复合物的可能下游分子靶标进行了相关实验研究。

Krönke等[19]使用SILAC为基础的定量质谱研究分析多发性骨髓瘤细胞系MM1S经来那度胺处理后细胞内相关蛋白的变化情况，发现来那度胺结合DDB1、CRBN，与CUL4、ROC1共同形成E3泛素连接酶，增加了B细胞转录因子Ikaros家族锌指蛋白1和3(Ikaros family zinc finger proteins 1、3，IKZF1、IKZF3)与CRBN-DDB1泛素连接酶的结合，诱导其降解，且为剂量依赖性，并且通过突变的CRBN证明了CRBN对于IKZF1和IKZF3调节的重要性；同时发现了1个58个氨基酸序列的敏感区，且该结构存在于锌指结构域2，该结构域中氨基酸的变化可以引起对来那度胺不同的敏感性。

来那度胺与CRBN结合，从而获得了降解IKZF1和IKZF3的能力，Lu等[20]的研究也证实了该结论。Zhu等[21]通过使用慢病毒表达载体感染人类多发性骨髓瘤细胞，共发现了244种CRBN的结合蛋白，并且通过在来那度胺治疗后含量的变化情况，确定了其与多发性骨髓瘤的生物学相关性，发现在来那度胺治疗后，46种CRBN结合蛋白含量降低，IKZF1在3/5种的免疫调节药物耐药的细胞系明显降低；在44例使用泊马度胺及地塞米松治疗的耐药多发性骨髓瘤患者存在较低的IKZF1基因表达水平，预示着对治疗缺乏反应；除此之外，还发现IKZF1与KPNA2水平同样与总生存率方面的区别相关。

4小结

通过对上述有关CRBN与免疫调节药物抗骨髓瘤相关性的研究进行综述，发现免疫调节药物显著改善了多发性骨髓瘤患者的反应率及生存率，改变多发性骨髓瘤治疗的革命化时代正在到来。还希望更多有关CRBN高纯度抗体及其晶体结构的研究，以促进药物耐药机制的进一步发展，以及更有效的、低毒性的药物出现，尤其是非致畸性的免疫调节药物。除此之外，需要大样本、多中心的CRBN与多发性骨髓瘤患者临床反应率及生存时间的相关性研究以验证其检测价值。

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Advances and clinical importance of cereblon in multiple myeloma

ZHAO Yong-feng,WANG Xian*

(Department of Hematology,the First People′s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,China)

[Abstract]The immunomodulatory drugs,including thalidomide,lenalidomide and pomalidomide,play an important part in treatment response and prognosis of patients with multiple myeloma.Cereblon (CRBN) was first found to be associated with autosomal recessive non-syndromic mental retardation.There were studies which discovered that it not only was the teratogenic target of the immunomodulatory drugs,but also was associated with clinical response rate of these drugs in multiple myeloma and the patients′ survival time.It is presumed that CRBN probably mediates anti-myeloma activity by binding to DDB1-CUL4-ROC1 and forming an E3 ubiquitin ligase complex.Many studies about the molecular mechanism and clinical associativity of CRBN are needed to pave the way to an developed understanding of drug resistance of immunomodulatory drugs and the appearance of more effective,hypotoxic drugs,thereby advancing the quality of life for patients with multiple myeloma.

Key words：Multiple myeloma;Immunomodulatory drugs;Cereblon

收稿日期：2015-08-13

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604036