支气管哮喘与糖皮质激素受体基因bcl-I单核苷酸多态性的关系

云哲琳, 王冬梅, 曲艳杰

(1. 内蒙古医科大学第三附属医院, 内蒙古 包头, 014010;2. 内蒙古自治区包头市第四医院, 内蒙古 包头, 014030)



支气管哮喘与糖皮质激素受体基因bcl-I单核苷酸多态性的关系

云哲琳1, 王冬梅2, 曲艳杰2

(1. 内蒙古医科大学第三附属医院, 内蒙古 包头, 014010;2. 内蒙古自治区包头市第四医院, 内蒙古 包头, 014030)

摘要:目的研究糖皮质激素受体(GR)基因bcl-I单核苷酸多态性与儿童支气管哮喘的相关性及其与血浆皮质醇浓度的关系。方法 应用聚合酶链反应和限制性长度片段多态性(PCR-RFLP)的方法对76例哮喘儿童和50例健康儿童行糖皮质激素受体基因bcl-I单核苷酸多态性的检测。应用放射免疫法对2组儿童行血浆皮质醇浓度的测定。结果GR基因bcl-I位点在2组中发现3种基因型的存在，分别为CC纯合型，GG纯合型和CG杂合型。CC, CG, GG型频率在哮喘发作组中分别为48.7%, 27.6%, 23.7%，在健康对照组中分别为76%，20%，4%，差异有统计学意义(P<0.05)。G等位基因的频率在哮喘发作组为37.5%, 显著高于对照组的14%，表明G等位基因与哮喘存在相关性。结论GR基因bcl-I单核苷酸多态性与哮喘的发病存在相关性。等位基因G可能为哮喘激素抵抗的易感基因。激素抵抗与血浆皮质醇浓度无关。

关键词:支气管哮喘；糖皮质激素受体；基因多态性；激素抵抗

支气管哮喘是儿童时期的常见病与多发病，它是由多种细胞(如肥大细胞、T细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。糖皮质激素(GC)作为临床治疗哮喘的主要药物之一，可以明显改善患者喘息、咳嗽、咳痰等症状，提高哮喘患者的生存质量。但有部分患者即使长期或大剂量给予激素，其疗效仍不理想，称为激素抵抗型哮喘[2]。糖皮质激素发挥药理、生理等效应需要糖皮质激素受体(GR)来介导。GR基因位于5q1-3，研究[3]表明5号染色体长臂(5q)上分布着众多的基因，可能在IgE合成的调节和过敏及哮喘相关炎症的发生发展中起重要作用。作者运用聚合酶链-限制性长度片段多态性(PCR-RFLP)技术，测定GR基因bcl-I单核苷酸多态性，探讨其与支气管哮喘发病的关系，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

根据2008年中华医学会修订的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[4]的标准，选取2013年10月—2015年10月包头市第四医院门诊及病房确诊的哮喘患儿76例为哮喘组，年龄4～15岁，平均年龄为(8.97±2.93)岁，男54例，女22例。选取同期健康儿童50例为对照组，年龄5～16岁，平均年龄为(9.08±3.00)岁，男35例，女15例。2组年龄、性别无显著差异(P>0.05)。经患儿及家长同意配合做激素抵抗者44例，口服强的松1 mg/kg，连服7 d。治疗前后行肺功能检测，FEV1改善低于15%为激素抵抗哮喘患儿[5]。

1.2方法

所有研究对象于晨起空腹采集EDTA抗凝外周血2 mL进行细胞和血浆分离，分离后置于-20 ℃冰箱保存。分离出的含有细胞成分的沉淀部分行GR基因bcl-I单核苷酸多态性检测，血浆部分集中行血浆皮质醇浓度检测。

糖皮质激素受体基因bcl-I单核苷酸多态性的测定: ① 基因组DNA的提取。从分离出的含有细胞成分的沉淀部分进行单个核细胞提取DNA, -20 ℃保存待检。② PCR扩增。引物根据参考文献[6]设计，由生工生物工程(上海)有限公司合成，上游引物为5′-GAGAAATTCACCCCTACCAAC-3′, 下游引物为5′-AGAGCCCTATTCTTCAAACTG-3′。反应体系为25 μL, 其中包括10 ×Buffer 2.5 μL、MgCl22.5 μL, dNTP 2.0 μL、上下游引物各1 μL, Taq酶0.25 μL, DNA 3 μL, 双蒸水12.75 μL。反应条件: 94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性45 s, 57 ℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共进行38个循环, 72 ℃延伸5 min。③ PCR产物酶切处理。取PCR扩增产物10 μL, 加bcl-I限制性内切酶1.2 μL, 10×Loading Buffer 2 μL, 蒸馏水7 μL, 37 ℃水浴10 h。④ 电泳。以PCR Markers作为DNA片段的标准参照物，应用2%琼脂糖(4.0 g/dL)溴乙锭凝胶方法电泳(电压120 V, 20 min), 在紫外透射自动成像分析仪上进行成像，记录结果。

血浆皮质醇(Cor)浓度测定采用放射免疫法。分离后的血浆按照人血浆皮质醇浓度试剂盒(由北京北方生物研究所提供)要求行皮质醇浓度的测定。

1.3统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据处理，计数资料间的比较采用卡方检验，计量资料采用均值±标准差表示，采用t检验和方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

PCR扩增产物电泳结果见图1。各组基因型及等位基因基因频率比较见表1。本次PCR扩增产物经电泳分析证实，哮喘儿童中bcl-I基因存在CC纯合型、GG纯合型、CG杂合型3种基因型。GG基因型在哮喘组中的频率分布显著高于对照组(P<0.05); G等位基因的频率在哮喘组为37.5%，也显著高于对照组的14%(P<0.05)。说明G等位基因与哮喘的发生存在相关性。2组血浆皮质醇浓度的测定结果见表2。CC组激素敏感例数为19例，激素不敏感例数为4例，激素敏感率为82.61%; GG组和GC组激素敏感例数为6例，激素不敏感例数为15例，激素敏感率为28.57%。CC组激素敏感率显著高于GG和GC组(P<0.01)。不同激素治疗组的皮质醇浓度无显著差异。见表3。

与对照组比较, *P<0.05。

3讨论

3.1GR基因变异对功能的影响

GC的生物学效应需通过GR介导。GR是一种配体激活的内源性转录因子，主要位于胞浆内，属于核受体家族，并已被正式命名为NR3C1(nuclear receptor subfamily 3, group C，member 1)[7]。人类NR3C1共有10个外显子[8]，第9外显子处经可变剪接产生两种同源的mRNA和蛋白质亚型，即GRα和GRβ，GR亚单位与热休克蛋白90(HSP90)、热休克蛋白70(HSP70)形成复合物，处于未激活状态；GC扩散进入胞浆内，并与GR-Hsp结合，同时Hsp被分离。GC和GR复合物进入细胞核，与靶基因启动子序列的GRE结合，激活或抑制靶基因的转录活性，调节蛋白质的合成，此即为GC的“基因组效应机制”[9]。因而GR的基因变异造成的蛋白结构异常或基因表达的改变，将影响受体的数量和结合力，从而影响GC的作用，进而引起激素抵抗。Tuckemann等[10]采用选择性GR突变小鼠来研究激素的抗炎机制，发现激素受体间存在DNA连接缺失的小鼠显示了对激素治疗的抵抗。多态性的激素受体基因还可以引起相关细胞因子(如IL-4)或各种诱导激素抵抗的关键分子的过度表达[11]，这可能跟GC敏感性下降有关。

3.2GR基因bcl-I单核苷酸多态性与哮喘激素抵抗

Hurley等[12]发现，GR基因突变能够导致家族性糖皮质激素抵抗。有研究证实GR基因突变可引起GR分子结构和功能异常，导致家族性糖皮质激素抵抗或获得性糖皮质激素耐药。目前，国内外对GR基因多态性的研究主要集中在bcl-I、ER22/23EK以及N3635这3个多态性上，而且阴阳性结果报道均不少。

bcl-I多态性是指在GR基因外显子2下游646个核昔酸处有一突变，即C→G(TGATCA→TGATGA)[13]。早在1992年，Weaver等[14]率先对bcl-I多态性进行了研究，发现携带该多态性突变基因的纯合子组人群空腹胰岛素水平及胰岛素抵抗指数均较高。2006年Anja Rogausch等[15]对患有支气管哮喘、COPD这些气道阻塞性疾病的患者进行了bcl-I多态性与吸烟行为的研究，发现该多态性的存在与人群对尼古丁的依赖性及其严重程度相关。此外，在使用GC治疗肺纤维化过程中，患者对GC的治疗反应高低不一致，这一事实让Harriet Corvol等学者们大胆猜测GR基因多态性可能会诱发肺纤维化患者体内炎症反应过程发生改变，从而影响患者对GC的敏感性。Harriet Corvo1等[16]对255例年轻肺纤维化患者的GR基因4处多态性(即Tthlll、ER22/23EK、N363S和bcl-I)进行检测并跟踪观察各病例的疾病演化进程。结果发现，携带bcl-l基因的患者第1秒用力呼气容积(FEV1)和用力肺活量(FVC)均呈下降趋势，其中突变基因型纯合子组(GG)患者比其他两种基因组合形式bcl-I-GC、CC的FEV1和FVC下降更明显，故由实验结果推测，bcl-I多态性可能与调控纤维化肺组织的炎症反应有关，干扰GC正常发挥抗炎效应，从而加速肺纤维化患者肺功能的恶化。bcl- I的多态性在体质量指数、血压、胆固醇水平代谢紊乱和各种机能紊乱中潜在的相关性已被广泛研究[17-19]。Tadeusz Pietras等[6]就GR激素受体基因bcl-I单核苷酸多态性与哮喘的关系做了初步探索，结果显示bcl-I的多态性与哮喘抵抗相关。

本研究的76例哮喘儿童中，有44例患儿配合做了激素抵抗的测试，其中19例存在激素抵抗。作者通过进行GR基因bcl-I单核苷酸多态性分析，发现这19例患儿中，有4例表现出CC基因型，其余15例为含G等位基因的GG基因型及CG基因型，而激素抵抗患儿的平均皮质醇浓度并无增高。由此作者分析，等位基因C突变为G, 导致GR结构及功能发生改变，降低糖皮质激素与之结合产生的药理作用，出现激素抵抗现象。bcl-I单核苷酸多态性不仅与儿童支气管哮喘的发病有关，等位基因G可能还是激素抵抗的易感基因，该结论与Tadeusz Pietras等[6]研究一致。众所周知，哮喘的发病是多基因、多因素作用的结果，糖皮质激素受体基因其他位点的基因多态性的存在与哮喘之间的关系尚有待于进一步的探讨。这些都有待于以后进一步扩大研究样本，或多中心，大样本的研究。

3.3bcl-I单核苷酸多态性与哮喘激素抵抗及血浆皮质醇浓度

皮质醇是一种主要由肾上腺皮质束状带分泌的糖皮质激素，属于21碳类甾体激素。目前临床上将糖皮质激素抵抗分为原发性糖皮质激素抵抗和获得性糖皮质激素抵抗，前者多为家族性，以血浆皮质醇水平升高而没有Cushing综合征表现，下丘脑-垂体-肾上腺轴对地塞米松抵抗以及GR亲和力缺陷为特征。大部分家族性糖皮质激素抵抗患者存在GR基因突变所致的GR功能缺陷。本实验测定了76例哮喘儿童及50例健康儿童的血浆皮质醇浓度，对实验结果进行统计分析，发现各组间及各组中不同基因型之间血浆皮质醇浓度无显著差异，说明患者内源性的皮质激素分泌和代谢功能正常，没有肾上腺皮质功能不足的临床特点，也没有糖皮质激素的吸收障碍、代谢加速、清除加快等表现。这表明哮喘激素抵抗与血浆皮质醇浓度无关，由此作者初步认为GR基因bcl-I单核苷酸多态性是导致哮喘激素抵抗的重要因素，等位基因G可能是哮喘激素抵抗的易感基因。

参考文献

[1]李明华, 殷凯生. 哮喘病学(第2版)[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2005: 1.

[2]Barnes P J. Glucocorticosteroids: current and future directions [J]. Br J Pharmacol, 2011, 163 (1): 29 - 43.

[3]Theriault A, Boyd E, Harrap S B, et al. Regional chromosomal assignment of the human glucocorticoid receptor gene to 5q31[J]. Hum Genet, 1989, 83: 289-291.

[4]中华医学会儿科学分会呼吸学组. 儿童支气管哮喘诊断与防治指南[J]. 中华儿科杂志, 2008, 46(10): 745-753.

[5]中华医学会呼吸病学会哮喘学组. 支气管哮喘防治指南[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2008, 31(3): 177-185.

[6]Pietras T, Panek M. The Bcl I single nucleotide polymorphism of the human glucocorticoid receptor gene h-GR/NR 3C1 promoter in patients with bronchial asthma: pilot study[J]. Mol Biol Rep, 2010, 38(6): 3953-3958.

[7]Nuclear Receptors Nomenclature Committee. A unified nomenclature system for the nuclear receptor super family[J]. Cell, 1999, 97(2): 161-163.

[8]Panek M, Pietras t, Kuan P, et al. The analysis of the factors influencing the development of glucocorticoid resistance in the etiopathogenesis of severe bronchial asthma[J]. Postepy Biochem, 2010, 56(4): 373-382.

[9]Pietras T, Panek M, Kuna P, et al. Frequencies of Bcl I, E22E, and N363S of h-GR/NR3C1 restriction fragment length polymorphisms of glucocorticoid receptor gene in Polish adult population [J]. Med Sci Monit, 2010, 16(10): CR475-479.

[10]Tuckermann J P, Kleiman A, Moriggl R, Spanbroek R, NeumannA, Illing A, et al. Macrophages and neutrophils are the targets forimmune suppression by glucocorticoids in contact allergy[J]. J ClinInvest, 2007, 117(5): 1381-1390.

[11]Koyano S, Saito Y, Nagano M, et al. Functional analysis of three genetic polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2003, 307(1): 110-116.

[12]Hurley D M, Katl M, Lamberts S W, et al. Familial glucocorticoid resistance caused by a splice site deletion in the human glucocorticoid receptor gene[J]. J Clin Endocrinol Metab, 1993, 76(3): 683-689.

[13]van Rossum E F, Koper J W, van den Beld AW, et al. Identifieation of the Bell Polymorphism in the glueocortieoid receptor gene: association with sensitivity to glucocorticoids in vivo and body mass index[J]. Clin Endocrinol(Oxf), 2003, 59(5): 585-592.

[14]Weaver J U, Hitman G A, KoPelman PG. An association between aBcll restriction fragment length Polymorphism of the glucoeortieoid receptor locus and hyPerinsu-linaemia in obese women[J]. J Mol Endocrinol, 1992, 9(3): 295-300.

[15]Rogausch A, Kochen M M, Meineke C, et al. Assoeiation between the Bcll glucocorticoid receptor Polymorphism and smoking in a sample of Patients with Obstruetive airway disease[J]. Addict Biol, 2007, 12(1): 93-99.

[16]CorvoI H, Nathan N, Charlier C, et al. Glueocortieoid receptor gene Polymorphisms Associated with Progression of lung disease in young Patients with cystic fibrosis[J]. Respir Res, 2007, 8(1): 88-96.

[17]Rosmond R. The glueocorticoid receptor gene and its association to metabolic syndrome[J]. Obesity Res, 2002, 10(10): 1078-1086.

[18]Bray P J, Cotton R G. Variations of the human glucocorticoid receptor gene (NR3C1): pathological and in vitro mutations and polymorphisms[J]. Hum Mutat, 2003, 21 (6): 557 - 568.

[19]Maltese P, Canestrari E, Palma L, et al. High resolution melting (HRM) analysis for the detection of ER22/23EK, Bcl I, and N363S polymorphisms of the glucocorticoid receptor gene[J]. Steroid Biochem Mol Biol, 2009, 113(3/4/5): 269-274.

Relationship between bronchial asthma and glucocorticoid receptor gene bcl-I single nucleotide polymorphism

YUN Zhelin1, WANG Dongmei2, QU Yanjie2

(1.TheThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou,InnerMongolia, 014010;2.BaotouFourthHospital,Baotou,InnerMongolia, 014030)

KEYWORDS:asthma; glucocorticoid receptor; gene polymorphism; hormonal resistance

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the relationship between bronchial asthma and glucocorticoid receptor gene bcl-I single nucleotide polymorphism and to analyze the relationship between asthma and the plasma cortisol level. MethodsPolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) techniques were used to determine the bcl-I single nucleotide polymorphism of the glucocorticoid receptor gene in 76 subjects with asthma and 50 normal controls respectively. The plasma cortisol levels were detected by radioimmunoassay in two groups. ResultsThere were three genotypes in bcl-I gene, which were genotype CC, GG and CG. The frequencies of CC, CG, GG genotypes were 48.7%, 27.6%, 23.7% in asthma group and 76%, 20%, 4% in control group, and there were significant differences (P<0.05). Frequency of G allele in asthma group was 37.5%, which was significantly higher than 14% in control group (P<0.05). G allele was associated with asthma. ConclusionThe bcl-I polymorphism of GR gene is significantly associated with bronchial asthma. G Allele may be a risk factor for steroid-resistance. Steroid-resistance is not associated with the plasma cortisol levels.

收稿日期:2015-12-16

基金项目:内蒙古自治区包头市医药卫生科技计划项目(BK2011265)

通信作者:王冬梅

中图分类号:R 562.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)11-021-04

DOI:10.7619/jcmp.201611007