副溶血弧菌检测方法研究进展

李红娜,袁　飞,周伟娥,罗云敬,张　峰，*,李绍辉

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100176;2.北京工业大学,北京 100124)



副溶血弧菌检测方法研究进展

李红娜1,2,袁飞1,周伟娥1,罗云敬2,张峰1，*,李绍辉1

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100176;2.北京工业大学,北京 100124)

副溶血弧菌是海产品中常见致病菌,可引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等疾病。由于我国是海产品消费大国,所以必须建立快速、准确、灵敏的方法监测海产品中的副溶血弧菌。目前主要应用分子生物学方法和分析化学方法,从细胞水平和分子水平来检测副溶血弧菌,主要包括实时荧光定量PCR和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS),这两种方法可以对副溶血弧菌进行准确定性和定量,是检测食品中副溶血弧菌的快速、特异、灵敏的方法,可用来评估和监管海产品污染副溶血弧菌的风险,保证人们的饮食安全。

食品安全,副溶血弧菌,实时荧光定量聚合酶链式反应,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

副溶血弧菌是海产品引起食物中毒的常见病原菌,适合生长的温度范围为15～44 ℃,-20～10 ℃容易死亡[1]。吴永宁等[2]对中国2003～2008年间的由副溶血弧菌食源性致病菌引发的食物中毒事件进行了总结,该致病菌可引起人急性肠胃炎,使人发生恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状[3],副溶血弧菌引起人食物中毒常发生在4月到10月份,常见引起食物中毒食物为肉及肉制品、海产品等,通常表现为交叉污染。副溶血弧菌引起人类疾病的途径除了饮食外,还可以通过皮肤接触产生,如人类皮肤接触到被副溶血弧菌感染的水后会引起伤口感染、肠胃炎或者败血症等[4],因此对于副溶血弧菌的监测除了市场上流通的海产品,还需对娱乐水域的水环境进行监测。

耐热直接溶血素(TDH)和耐热直接相关溶血素(TRH)是副溶血弧菌的两个主要的毒力因子,这两种物质结构非常相似,都由二聚体构成,并有相似的溶血活性,维持二聚体结构是保持溶血活性必不可少的[5]。经腹腔注射表明,只有具有溶血活性的菌株具有毒性[6]。Sadok Khouadja等[7]研究表明,非致病性的副溶血弧菌可能是毒力基因库,可水平转移产生新的致病菌,为保证人们的饮食健康和生命安全,需要建立快速、准确、行之有效的方法对致病性副溶血弧菌及非致病性副溶血弧菌进行全面监测。

本文对近几年副溶血弧菌的检测方法进展进行了概括,为保障人们的饮食卫生和娱乐水域安全提供保障。

1　菌体检测

食品中对于菌体的检测的目的是对菌落进行定量或者定性,菌体的检测方法主要有平板计数法、生化实验法、菌落杂交法、质谱法及免疫层析法。其中平板计数法属于定量方法,生化实验法属于定性方法,菌落杂交和免疫层析法属于定性及半定量法,质谱法属于定性和完全定量法。

1.1平板菌落计数法

将样品研磨并配成溶液,稀释一定的浓度梯度,采用倾注法或者涂布法将样品接种于培养基上,在一定的条件下进行培养,一定稀释倍数的样品中的细菌可单个分散在平板上形成肉眼可见的菌群,菌群的数量代表细菌总数,这里的菌落总数是指符合该培养条件的菌的总数,不是绝对的活菌数量。细菌在存活非培养状态时不能形成菌落，可能会造成检测的菌落总数低于实际菌落总数[8]。

1.2生化实验法

根据菌种的生理生化及表观特征对菌种进行鉴定,是微生物鉴定的常用方法,目前全自动微生物鉴定仪已经成为一套成熟的微生物鉴定系统。典型的副溶血弧菌在硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖(TCBS)琼脂培养基上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落,具有氧化酶阳性、赖氨酸脱氢酶阳性、硫化氢阴性、有动力、发酵葡萄糖和甘露醇、不发酵蔗糖和乳糖等生化特征[9]。与MALDI-TOF MS和16S rDNA聚合酶链式反应相比,全自动微生物鉴定仪VITEK2只能对菌属进行准确定性而不能准确区别菌种。VITEK微生物鉴定仪是根据微生物的生理生化特征进行鉴别微生物,而同一菌属之间的菌种生化特征差别不大,因而在菌种鉴别上受到很大限制,数据库的存储的菌种数据需要进一步扩充和更新[10-12]

1.3菌落杂交法

基于菌种的特异性基因设计探针,用放射性同位素或者荧光物质标记探针,通过裂解细菌使探针与细菌特异性基因结合,通过检测信号判断阳性或者阴性。Elisabetta Suffredini等[13]建立了菌落杂交法对总副溶血弧菌进行计数。采用异羟基洋地黄毒甘标记4种探针,tdh1、tdh2、trh1和trh2,检测了70株标准菌株和356株从环境、食品和临床分离得到的菌株,特异性能达到100%,线性相关系数在0.895～0.987之间。采用菌落杂交法、国际标准法和菌落计数法检测了104个天然样本,菌落杂交法和国际标准法的准确度可达到86.7%,菌落杂交法可替代菌落计数法检测海产品中的致病性副溶血弧菌。J R López等[14]建立了反向线点杂交技术检测黄杆菌属、弧菌属、发光杆菌属及假单胞菌。根据16-23S基因间隔区的特异性片段或者23S rRNA的特异性片段制备特异性的生物探针,标准菌株和临床分离菌株通过反向线点杂交均能准确鉴别,除了哈维氏弧菌的探针与坎氏弧菌扩增产物有交叉反应外,其余非目标菌株均表现为阴性。这是第一个鉴别鱼类细菌性病原体的反向线点杂交方法,对于水产养殖的流行病学研究和疾病控制具有重要意义。菌落杂交法费时费力,且可能出现非特异性结合的现象而使检测结果出现假阳性。

1.4质谱法

是根据待测微生物的蛋白指纹谱图与蛋白指纹谱图库进行特征比较,快速对微生物进行定性。René Erler等[15]建立了弧菌属的质谱谱图库,检测的准确度高,而且可开放获取,可用于海洋环境弧菌的检测。SM Malainine等[16]应用MALDI-TOF MS检测贝类、海水及沉积物中副溶血弧菌,可以将特征相似的菌株进行区分,定性准确度高。

质谱法可以准确鉴定菌种之间的差异,是一种高精度定性的方法,但对于条件致病菌铜绿假单胞菌,质谱法并不能准确鉴别,所以,质谱法也存在缺陷,数据库有待完善[17]。

1.5免疫层析法

通过菌体表面的特异性抗原制备得到单克隆抗体,然后将抗体固定于载体表面,根据抗原抗体的特异性结合产生显色反应,检测样品中是否含有目标抗原。Junko Sakata等[18-19]建立了免疫层析法检测平板上的副溶血弧菌,检测了124株副溶血弧菌、94株其他弧菌及35株非弧菌属菌株,均可以准确鉴定。针对副溶血弧菌的F0F1 三磷酸腺苷合成酶抗原得到的两种单克隆抗体mAb-VP34和mAb-VP109,由于这些抗原为高保守区的序列产物,几乎所有的副溶血弧菌都存在相同的抗原,所以这种免疫分析方法出现假阴性的概率很小。这种方法简单、快速,克服了副溶血弧菌在鉴别培养基上出现不同颜色反应的缺点,而且常规的生化检测需要至少3 d时间,免疫层析法只需30 min就可得到检测结果。免疫层析法操作较为复杂,主要表现在单克隆抗体制备的环节,也可能因为形同的抗原表位而出现交叉反应,出现假阳性结果。

2　基因检测

根据菌体的特异性基因片段对菌种进行检测和鉴定,是一种特异性强,耗时短,灵敏度高的分子生物学方法,应用广泛。

2.1基因探针法

基因探针是根据待测菌种的特异性基因片段制备的互补配对的寡核苷酸链,基因探针需用放射性元素或者荧光标记,根据检测标记信号判断待测样品中是否含有目标基因。多个基因探针整合在一起,制成基因芯片可以同时检测多种基因,是一种高通量方法。Yu-Ri Kim等[20]采用DNA阵列杂交法将弧菌属进行了分类,DNA阵列由23个弧菌属的分子伴侣groESL基因间隔区的非转录基因片段组成,DNA阵列杂交可以准确区分副溶血弧菌和创伤弧菌。

2.2聚合酶链式反应

根据目标菌的标志性基因设计特异性引物进行体外扩增,然后用EB染料对扩增产物进行染色,进行葡聚糖凝胶电泳,在紫外成像仪下观察电泳条带,判断待测样品是阴性还是阳性。Muhammad Tofazzal Hossain等[21]采用多重聚合酶链式反应检测和鉴别副溶血弧菌,引物设计的对象为生物特异性标志物,分子伴侣groEL、耐热直接溶血素tdh和耐热直接相关溶血素trh,经过人工污染样品检测表明该方法可用于快速检测和鉴别副溶血弧菌分离菌株。Mohammadjavad Paydar等[22]建立了传统PCR结合基因外重复回文序列PCR技术来检测和鉴别副溶血弧菌。多重PCR检测编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白基因gyrB和管家基因pntA,可以有效筛选副溶血弧菌,而REP-PCR可以对不同血清型进行鉴别。

2.3实时荧光定量PCR

与普通PCR相比,省去了用EB染色的部分,操作更加安全;实时监测反应结果,避免出现假阳性现象;可以对菌种进行绝对定量。Annick Robert-Pillot等[23]建立了以水解探针为目标基因的实时荧光PCR技术来检测和鉴定副溶血弧菌、创伤弧菌及霍乱弧菌,这种方法特异性强,可用于海鲜中弧菌类致病菌的检测。Min-Hee Kang等[24]建立了2步快速实时荧光PCR检测副溶血弧菌的耐热直接溶血素基因tdh,这种方法所需样品量少,特异性强,准确率高,是目前检测副溶血弧菌的最快的方法。Alejandro Garrido等[25]采用多重实时荧光PCR检测水和海产品中的副溶血弧菌。目标基因为thd、trh1和trh2,检测限分别为6、11、8 cfu/25 g。国际标准ISO 21872-1:2007检测总副溶血弧菌需要至少3 d时间,而多重实时荧光PCR检测及鉴别副溶血弧菌只需24 h。这种方法是实用性强、操作简便、特异性强、灵敏度高的高通量检测方法。

2.4环介导等温PCR

环介导等温PCR是一种较为温和核酸扩增方法,与普通PCR相比,特异型性更强,灵敏度更高,而且比荧光PCR成本低,所需设备简单,应用范围较广。Tan Turk Hsern Malcolm等[26]比较了环介导等温PCR和多重PCR检测海产品中的副溶血弧菌,结果表明,虽然这两种方法的检测结果区别不太,但是在样品中目标菌株含量较低时环介导等温扩增法比多重PCR更具有优势。

3　代谢物检测

检测菌种的特异性标志物,是鉴别菌种的一种重要手段,检测的目标主要为毒素及酶类。副溶血弧菌的主要代谢毒素为耐热直接溶血素、耐热直接相关性溶血素等。

3.1酶联免疫吸附法

酶标记抗体与固定在载体表面的抗原或者抗抗体特异性结合,用适当的溶剂冲洗载体表面,去除没有结合的酶标抗体,然后加上酶底物,底物与酶发生显色反应,根据颜色的深浅判断待测样品中是否含有待测物质。Ballamoole Krishna Kumar等[27]建立了酶联免疫吸附实验检测副溶血弧菌的耐热直接溶血素TDH,由于耐热直接溶血素和耐热相关直接溶血素具有相似的抗原表位,所以,ELISA的方法并不能加以区别,这种方法可用于常规的实验室检测,就有高通量、简单、快速的优点,但是需要专业人员和专业技术。

3.2基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法

是一种新兴的生物质谱,具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点,为生命科学领域提供了一种强有力的分析测试手段。副溶血弧菌产生的耐热直接溶血素(TDH)是一种成孔毒素,可以溶解真核细胞。Silke Bechlars等[28]进行体外合成标签TDH,并用聚丙烯酰氨凝胶电泳、基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱及免疫学方法进行检验,发现TDH的前体及衍生物均没有溶血活性。

3.3高效液相色谱法

高效液相色谱应用领域较广,是最有效的分离分析手段,绝大多数化合物都可用高效液相色谱进行检测,在高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物分析方面具有明显优势。Baskar Balakrishnan等[29]采用高效液相色谱方法检测了副溶血弧菌产的弧菌素,高效液相方法在分离混合物方面具有很大的优势,可以帮助分离菌株培养混合物,发现菌株的特异性代谢产物,是鉴别不同菌株的有效方法。

4　展望

副溶血弧菌感染海产品引起食物中毒的危害巨大,目前海产品中检测副溶血弧菌的有效方法多为实时荧光定量PCR,虽然检测的灵敏度、特异性、准确度都很高,但是所需仪器设备昂贵,检测成本较高,环介导等温PCR技术在灵敏度、特异性方面都优于普通PCR,与实时荧光PCR相比,成本更低,是一种可替代方法。

目前检测副溶血弧菌的方法主要是针对活菌进行检测,而对于副溶血弧菌的代谢毒素检测不够重视,副溶血弧菌的代谢产物耐热直接溶血素是一种耐热、耐胰蛋白酶的多肽,是副溶血弧菌的主要毒力因子,其检测方法局限在免疫学方法,免疫学方法不仅耗时长,检测灵敏度低,而且特异性较差,需要建立新的快速、准确、灵敏、可靠的检测方法检测副溶血弧菌的毒力因子。此外,在开发有效抑制副溶血弧菌生长繁殖的抑制剂时,对于菌的活性状态的检测也是非常有必要的,这方面的检测技术也需要尽快建立。

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Research progress of detecting methods forVibrioparahaemolyticus

LI Hong-na1,2,YUAN Fei1,ZHOU Wei-e1,LUO Yun-jing2,ZHANG Feng1,*,LI Shao-hui1

(1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China;2. Beijing University of Technology,Beijing 100124,China)

Vibrioparahaemolyticuswhich can cause illness like nausea,vomit,stomachache and diarrhea etc. is ubiquitous pathgenic bacteria in seafood. China is a consumption country of seafood,it is necessary to establish rapid,accurate and sensitive method monitoringVibrioparahaemolyticusin seafood. At present,molecular biology methods and analytical chemistry methods based on cell level and molecular level include real-time PCR and MALDI-TOF MS uauslly be used to determine and quantifyvibrioparahaemolyticusin seafood,which are fast,specific and sensitive. It can be used to evaluate and supervise the risk ofVibrioparahaemolyticusin seafood and ensure the safety of people’s diet.

food security;Vibrioparahaemolyticus;real-time PCR;MALDI-TOF MS

2015-11-09

李红娜(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：化学生物学与分子医学，E-mail：lihongna1@163.com。

张峰(1974-)，男，博士，研究员，研究方向：分析化学，E-mail：fengzhang@126.com。

公益性行业科研专项经费项目(201510038)；国家质检总局科技计划项目(2014IK084)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)12-0371-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.062