超声-微波回流提取新疆管花肉苁蓉苯乙醇苷的工艺研究

丁慧玲,许丹丹,金天佑，张红玉，王　亮

(新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046)



超声-微波回流提取新疆管花肉苁蓉苯乙醇苷的工艺研究

丁慧玲,许丹丹,金天佑，张红玉，王亮*

(新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046)

管花肉苁蓉是新疆特有药物资源。为了使其充分利用,在单因素研究基础上,通过响应面法优化超声-微波回流提取管花肉苁蓉中苯乙醇苷工艺。结果表明:在超声频率40 kHz,超声功率为50 W,提取时间15 min时由二次回归模型获得最优工艺条件为提取丙酮体积分数50%,液料比 14∶1(mL·g-1),微波功率100 W,理论得率为49.87%,验证实验得49.2%,与理论值接近。通过红外光谱分析可知超声-微波提取的是管花肉苁蓉苯乙醇苷类物质。

管花肉苁蓉,苯乙醇苷,超声-微波,提取,红外光谱

管花肉苁蓉(Cistanchetubulosa(Schenk)Wight)为列当科肉苁蓉属,多年生寄生草本植物,别名南疆大芸、管花大芸、红柳大芸,茎入药,有补精血、益肾壮阳、润肠通便之效用,世人称之为“沙漠人参”[1]。近年来国内外很多学者、专家对其化学成分和药理活性进行了研究,分离出了近百种化学成分,主要包括苯乙醇苷类、环烯醚萜苷、木脂素苷、单糖、双糖、多糖、氨基酸、多肽、蛋白质、三萜、甾醇、多元醇等,其中苯乙醇苷类是肉苁蓉属植物的主要活性成分之一,也是中国药典“肉苁蓉”项下鉴别和含量测定的指标性成分,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、助阳等作用[1-2]。因此,对管花肉苁蓉苯乙醇苷类成分的提取研究和产品开发都有极重要的意义。

丙酮是非质子性溶剂,极性大,溶解能力强,可以除去一些小分子糖和脂溶性杂质,在工业生产中由于它的沸点较低,后期有利于回收利用。

微波提取容易造成溶液受热不均,而超声波振动的空化效应使得样品介质各点受热一致,并不破坏物质本身的结构,超声-微波协同萃取,发挥了两者优点的同时又补充了各自的不足,从而提高了活性物质的提取得率、大大缩短提取时间、降低耗能,节约了成本,在做提取研究方面广泛应用。目前关于管花肉苁蓉苯乙醇苷提取工艺研究,主要有水提法、乙醇浸提法、超声波协助法、微波协助法、酶法辅助提取法等方法[3-7],而对于超声-微波协助回流提取工艺的研究鲜有报道[8]。

本研究以管花肉苁蓉为原料,前期的预实验通过甲醇、乙醇、丙酮这三种溶剂进行提取,得到实验结果是丙酮提取得率最高,因此选用丙酮为提取溶剂,采用Box-Behnken中心设计法对提取浓度、微波功率、提取液料比等关键因素进行优化,建立并验证相关的工艺数学模型,并对提取的苯乙醇苷进行了红外光谱分析[9]。为更好地利用新疆名贵濒危中药肉苁蓉资源提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

管花肉苁蓉由新疆生命核力高科股份有限公司提供,粉碎过筛得到粒径为80目的样品置于烧杯中备用;松果菊苷标准品(纯度98%)乌鲁木齐格林金诺生物科技有限公司;丙酮、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH等其它试剂均为分析纯,天津市富于精细化工有限公司。

HK-20B 1000 g摇摆式高速中药粉碎机广州市旭朗机械设备有限公司;CW-2000型超声-微波协同萃取仪(超声波固定频率40 kHz,功率50 W)上海新拓分析仪器科技有限公司;ME204E电子分析天平(0.0001 g)深圳市盛美仪器有限公司;RE-3000旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵上海科恒实业发展有限公司;Z-326K台式冷冻离心机靖江市新大机电设备制造有限公司;岛津UV-2450PC紫外可见分光光度计上海胜斯贸易有限公司;冷冻干燥机宁波生化仪器有限公司;FTIR-7600型傅里叶变换红外光谱仪天津港东科技发展股份有限公司;其他均为实验室常用设备。

1.2实验方法

1.2.1提取管花肉苁蓉苯乙醇苷的工艺流程新疆管花肉苁蓉→粉碎(过80目筛)→干燥→称重→超声-微波回流提取→抽滤,去上清液→3000 r/min离心10 min(取上清液)→减压浓缩→冷冻干燥2 d→肉苁蓉苯乙醇苷类物质。

1.2.2测定管花肉苁蓉苯乙醇苷含量

1.2.2.1绘制松果菊苷标准曲线精确称取10 mg松果菊苷对照品溶解在50 mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀。分别吸取以上溶液0、1、2、3、4、5 mL置于25 mL容量瓶中,采用比色法[10]测量吸光度,得到标准曲线的回归方程为y=0.0086x-0.0227,R2=0.9974。

1.2.2.2苯乙醇苷得率的计算每次取2 g管花肉苁蓉进行提取,提取后的溶液在3000 r/min的离心机中离心15 min,取上清液在100 mL的容量瓶中定容,在容量瓶中取1 mL的溶液经多次实验稀释300倍之后,按照1.2.2.1的方法测定吸光度,根据松果菊苷标准曲线建立的回归方程计算管花肉苁蓉中苯乙醇苷含量,然后按以下公式计算出苯乙醇苷得率:苯乙醇苷得率(%)=算出的苯乙醇苷含量×稀释倍数/管花肉苁蓉粉的质量×100

1.2.3超声-微波回流萃取管花肉苁蓉中苯乙醇苷

1.2.3.1单因素实验以丙酮体积分数(%)、微波功率(W)、液料比(mL/g)、提取时间(min)为考察因素,以肉苁蓉中苯乙醇苷得率为指标,确定响应面实验因素水平。

a.丙酮体积分数:称2 g管花肉苁蓉粉,按1.2.1进行预处理后,固定微波功率80 W,液料比10∶1,提取时间10 min,分别在丙酮水溶液体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的条件下进行超声-微波协同回流萃取。

b.微波功率:按最优的丙酮体积分数,液料比10∶1,提取时间10 min不变,分别在提取微波功率为 20、40、60、80、100、120 W的条件下进行萃取。

c.液料比:按最优的丙酮体积分数、微波功率,提取时间10 min不变,分别在液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的条件下进行萃取。

d.提取时间:按最优的丙酮体积分数、微波功率、液料比,分别在提取时间为10、15、20、25、30 min的条件下进行萃取。

1.2.3.2响应面优化实验设计在单因素实验结果的基础上,根据Box-Behnken实验设计原理[11-15],以丙酮体积分数、微波功率、液料比3个因素为自变量,管花肉苁蓉苯乙醇苷的得率为响应值,设计3因素3水平的响应面实验,实验设计见表1。并平行三次进行验证实验。

表1　响应面设计因素水平表

1.2.4红外光谱分析管花肉苁蓉苯乙醇肉苁蓉苯乙醇苷冷冻干燥成干粉,采用KBr压片法制样,采用傅里叶红外光谱进行红外光谱扫描,分析数据。

1.2.5实验数据分析方法使用Origin8.06、EXCEL进行图表的绘制,Design-Expert8. 06软件进行相关数据的处理。

2　结果与分析

2.1单因素实验结果

图1　丙酮体积分数对得率的影响Fig.1　Effect of volume fraction of acetone on the yield

2.1.1丙酮体积分数的影响如图1所示,随着丙酮体积分数的增加,苯乙醇苷得率提高,当丙酮体积分数达到50%时得率最大,这是因为苯乙醇苷类物质是极性化合物,易溶于极性溶剂。随着体积分数的继续增大,得率明显下降,这是由于大多数植物中的活性成分能在丙酮中溶解,使其与水溶性物质分离,因此一部分苯乙醇苷水溶性成分难以溶解。因此,实验选择丙酮体积分数为50%。

2.1.2微波功率的影响如图2所示,苯乙醇苷得率随微波功率增加而提高,当达到100 W时得率达到最大,之后随着功率增加而下降。这是由于超声-微波对肉苁蓉细胞壁的破碎作用随着功率的增加而逐渐增强,从而有利于苯乙醇苷类成分溶出,但当达100 W左右后,提取液温度较高,使得部分苯乙醇苷结构发生改变,从而降低得率,因此实验中选取100 W。

图2　微波功率对得率的影响Fig.2　Effect of microwave power on the yield

2.1.3液料比的影响如图3所示,随着液料比的增加,苯乙醇苷得率显著提高,在液料比达到15∶1时达到最大,之后随着溶剂用量的增加得率下降。这可能是由于液料比达到15∶1时,肉苁蓉中的苯乙醇苷几乎已经被萃取完全。另外,进一步加大溶剂用量,会增加后续浓缩工艺,进而得率损失加大,成本增加,因此实验选用液料比15∶1。

图3　液料比对得率的影响Fig.3　Effect of liquid-solid ratio on the yield

2.1.4提取时间的影响如图4所示,随时间的增加,苯乙醇苷得率提高,在15 min时得率达到最大,之后随着时间的增加得率先下降后保持不变,可能是因为作用时间延长使得提取液温度较高,破坏了苯乙醇苷的结构。为尽量降低高温对苯乙醇苷的造成破坏的可能性,尽量选择较短时间的处理。因此,实验选择提取时间15 min。

图4　提取时间对得率的影响Fig.4　Effect of extraction times on the yield

2.2响应面优化实验

依据软件Box-Behnken中心组合原理进行实验,结果见表2。处理表2的实验数据,得到回归模型方差分析表3,采用Design Expert 8.0.6软件进行多元回归拟合分析,得到以苯乙醇苷得率(Y)为目标函数的二次回归方程:Y=49.78+0.49A+0.24B-0.48C-0.6AB-0.27AC-0.72BC-1.32A2-3.62B2-1.74C2

表2　响应面法实验设计及结果

表3　回归模型方差分析表

注:**表示极显著(p<0.01);*表示显著(0.01

各因素的影响程度分析,各因素的F值可以反映出各因素对实验指标的重要性,F值越大,表明对实验指标的影响越大,即重要性越大。从方差分析表可知:FA=27.13,FB=6.44,FC=25.76,即各因素对苯乙醇苷得率的影响程度大小顺序为:丙酮体积分数>液料比>微波功率。

根据回归方程,做出响应面分析图(图5～图7),考察所拟合的响应曲面的形状,分析丙酮体积分数、液料比、微波功率对管花肉苁蓉苯乙醇苷得率的影响。

2.3双因素交互分析

由图5可知,AB交互影响极显著,随着丙酮体积分数和微波功率的增加苯乙醇苷得率也迅速增大。将微波功率固定在0水平时,随着丙酮体积分数的增加,苯乙醇苷得率呈缓慢上升趋势;增大微波功率,苯乙醇苷得率呈上升趋势,且趋势明显,并且在丙酮体积分数为50%,微波功率为100 W时,苯乙醇苷得率达到最大值。

图5　丙酮体积分数与微波功率交互的响应面图Fig.5　Response surface of the interaction between acetone concentration and microwave power

图6可知,AC的交互影响不显著,随着料液比的变化,苯乙醇苷得率有较小的上升趋势,料液比一定,苯乙醇苷得率随提取体积分数的增大而相应增大;丙酮体积分数固定时,苯乙醇苷得率受液料比的影响较小。

图6　丙酮体积分数与液料比交互的响应面图Fig.6　Response surface of the interaction between acetone concentration and liquid feed ratio

图7　微波功率与液料比交互的响应面图Fig.7　Response surface of the interaction between microwave power and liquid feed ratio

图7可知,BC的交互影响极显著,微波功率固定时,苯乙醇苷得率受液料比影响较大,随着液料比的增大呈先增后降的趋势。回归分析结果与3个因素对响应值的影响以及各因素之间的交互影响相吻合。可以看出在响应面的最高点和等高线所选的范围内存在极值。通过分析得到苯乙醇苷最佳超声-微波提取工艺条件为:提取浓度50.97%,液料比14.2∶1(mL·g-1),微波功率100.3 W,理论最佳得率为49.87%。根据实际情况按照提取体积分数50%,液料比14∶1(mL/g),微波功率100 W,进行3次平行验证实验,得到肉苁蓉苯乙醇苷的得率为49.2%,与理论值较为接近,有很好的拟合性。实验结果充分验证了所建模型的正确性,说明响应面法适用于超声-微波提取管花肉苁蓉苯乙醇苷工艺条件的回归分析和参数优化。而前期实验采用丙酮回流提取管花肉苁蓉苯乙醇苷,丙酮体积分数一般要在70%以上,提取液料比为20∶1,提取时间为1.5 h以上,得率最高为39.8%,与之相比较,超声-微波辅助提取时间缩短80%以上,提取液料比降低,大大提高了提取效率。

2.4管花肉苁蓉苯乙醇苷红外光谱分析

图8为管花肉苁蓉苯乙醇苷类物质的红外图谱,与苯环相连的C=O伸缩振动峰是1697.91 cm-1;在1603.91 cm-1有强度中等的吸收峰,这是苯乙醇苷类成分中的共轭C=O的特征吸收峰;1447.73和1380.81 cm-1附近的C-H的弯曲振动,说明管花肉苁蓉的化合物成分含有较多饱和烷基;管花肉苁蓉苯乙醇苷类物质的最高峰是1042.49 cm-1处尖锐的单峰,此外在1519.26,1271.62,1161.29 cm-1也都有不同程度的吸收,这些吸收峰均可作为管花肉苁蓉苯乙醇苷的鉴别特征峰。这一结果与徐荣等[16-18]红外光谱法用于肉苁蓉属中药鉴别研究结果相一致,因此,红外光谱分析结果表明通过超声-微波回流提取分离的物质为管花肉苁蓉苯乙醇苷类物质。

图8　管花肉苁蓉苯乙醇苷类物质的图谱Fig.8　Infrared spectrum of phenylethanoid glycosides extracted from Cistanche tubulosa

3　结论

通过响应面法优化超声-微波回流辅助提取新疆管花肉苁蓉苯乙醇苷的最优提取工艺参数为:在超声频率40 kHz,超声功率50 W,提取时间15 min,丙酮提取浓度50%,液料比14∶1(mL/g),微波功率100 W,验证值为49.2%,与理论值49.87%接近。与丙酮回流提取比较,超声-微波辅助回流提取时间缩短80%以上,提取的液料比大大降低,提取效率得到提高。同时,红外光谱分析图可得超声-微波辅助回流提取分离的物质为管花肉苁蓉苯乙醇苷物质。为进一步的开发中药材管花肉苁蓉提供理论依据。

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Ultrasonic microwave extraction technology of Xinjiang phenylethanoid glycosides fromCistanchetubulosa

DING Hui-ling,XU Dan-dan,JIN Tian-you,ZHANG Hong-yu,WANG Liang*

(The College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

Cistanchetubulosais endemic to Xinjiang.In order to make full use of its resources,on the basis of single factor tests，the ultrasonic microwave extraction technology of phenylethanoid glycosides fromCistanchetubulosawas studied through the response surface optimization method. And the characteristics was analyzed by the fourier infrared spectrum. The results showed that the ultrasonic frequency 40 kHz,the ultrasonic power was 50 W,the extraction time was 15 min. The optimum extraction conditions by quadratic regression model were as follows extraction concentration 50%,ratio of liquid-solid 14∶1(mL·g-1),extraction microwave power 100 W. The theoretical value of phenylethanoid glycosides yield was 49.87%,under this condition the verification value was 49.2%,which was closed to the theoretical value.Infrared spectrum analysis results showed that ultrasonic microwave extraction wasCistanchetubulosaphenylethanoid glycosides compounds.

Cistanchetubulosa;phenylethanoid glycosides;ultrasonic microwave;extraction;infrared spectrum

2015-11-24

丁慧玲(1991-)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail:m18709919028_1@163.com。

王亮(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品工程，E-mail：Wang-liang77@hotmail.com。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0301-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.048