响应面法优化落叶松阿拉伯半乳聚糖闪式提取工艺及其性质研究

陈　苑,李建霞,朱瑞倩,孙蒙蒙,董洁琼,王建中，*

(1.北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083；2.北京林业大学自然保护区学院，北京 100083)



响应面法优化落叶松阿拉伯半乳聚糖闪式提取工艺及其性质研究

陈苑1,李建霞2,朱瑞倩1,孙蒙蒙1,董洁琼1,王建中1，*

(1.北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083；2.北京林业大学自然保护区学院，北京 100083)

以华北落叶松为原料,采用闪式提取技术对落叶松中的阿拉伯半乳聚糖进行提取,在单因素实验的基础上,利用响应面法对闪提工艺进行优化,最终得到较优提取工艺参数为:提取温度为70 ℃,闪提时间为1.6 min,料液比为1∶16(g/mL),提取时间为22 min,此条件下阿拉伯半乳聚糖提取率为14.30%±0.05%。通过扫描电镜观察阿拉伯半乳聚糖样品,发现其呈不规则几何外形分布。通过红外吸收峰的分析,发现样品含有糖类化合物的典型基团,且趋势和标准品基本一致。

落叶松,阿拉伯半乳聚糖,闪式提取,扫描电镜,红外

阿拉伯半乳聚糖(Larixgmelinii)是从植物细胞壁中获得的一种活性多聚糖,由阿拉伯糖与半乳糖组成,是一类长的、高度支链的中性多糖[1]。国外学者对阿拉伯半乳聚糖的研究表明其具有较好的免疫活性[2],能够刺激免疫系统,阻断肿瘤细胞向肝脏转移[3],可能成为用于癌症治疗的一个有效辅助物。同时阿拉伯半乳聚糖也是一种良好的膳食纤维,摄入后能促进肠道内有益菌群数量增多[6]。在针叶树的木质部中大量含有此糖,尤其在落叶松(Larix)中可达5%～30%[7]。

目前国内对阿拉伯半乳聚糖的研究主要集中于分析其化学结构[8],微波提取[9]及超声波提取[10]工艺条件,闪式提取法(简称为闪提法)是近年来发展起来的一种新的提取技术,它利用闪式提取机的高速机械剪切力、搅拌力以及高速旋转的刀刃之间产生的涡流负压,迅速破坏植物组织细胞,使细胞内部的化学成分(或有效成分)与溶剂充分接触,溶解转移,并在很短时间内达到溶解平衡,实现高效提取的目的[11],具有快速高效、常温提取、无成分破坏等特点[12]。本研究以落叶松为原料,利用闪式提取技术对其中阿拉伯半乳聚糖进行提取,通过响应面设计优化提取条件,得到最佳提取工艺,并利用扫描电镜分析其表面特征及红外光谱分析阿拉伯半乳聚糖特征基团。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

落叶松购自河北赛罕坝机械林场;L-阿拉伯糖(≥99%)、D-半乳糖标准品(≥99%)、阿拉伯半乳聚糖标准品(≥99%)Sigma公司;苯酚、四水合酒石酸钾钠AR,西陇化工股份有限公司;浓硫酸、亚硫酸钠、氢氧化钠、葡萄糖AR,北京化工厂;无水乙醇AR,天津市光复科技发展有限公司;3,5-二硝基水杨酸CP,广东光华化学厂有限公司;针式滤膜过滤器过滤头Ф25 mm×0.45 μm天津市科亿隆实验设备有限公司。

FDV型气引式超细粉碎机台湾佑崎企业;HJ-3型恒温磁力搅拌器常州国华电器有限公司;JHBE-50S型闪式提取器北京金鼐科技发展有限公司;R-210型旋转蒸发仪瑞士BUCHI公司;T6型新世纪型紫外分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;S-3400N型扫描电子显微镜、E-1010型溅射镀膜机日本日立公司;Spectrum 100型FT-IR Spectrometer红外光谱仪美国PerkinElmer公司。

1.2实验方法

1.2.1总糖标准曲线的制作采用苯酚-硫酸法[14]。分别取0.2 mg/mL标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于试管中,各补加蒸馏水至2.0 mL,然后依次加入1.0 mL 6%的苯酚溶液,摇匀,迅速加入5.0 mL浓硫酸,静置10 min,摇匀,室温放置20 min,于490 nm测量吸光度A值。以2.0 mL蒸馏水按同样显色操作为空白对照。

1.2.2还原糖标准曲线的制作采用3,5-二硝基水杨酸比色法[15]。精确吸取1.0 mg/mL的葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中,各补加蒸馏水至1.0 mL,再加入3,5-二硝基水杨酸试剂1.5 mL,摇匀,沸水浴5 min后迅速冷却,加入8.0 mL蒸馏水,混匀,放置20 min后,于550 nm测量吸光度A值。以1.0 mL蒸馏水按同样显色操作为空白对照。

1.2.3落叶松阿拉伯半乳聚糖得率测定将落叶松木屑用粉碎机粉碎,过40目筛,得落叶松木粉。准确称取10.0 g本品粉末,加入一定量蒸馏水,在一定条件下进行闪式提取,然后放于恒温磁力搅拌器上进行提取,结束后静置,用注射器吸取上清液,通过针式滤膜过滤器过滤头,将滤液收集,以制备标准曲线的方法,测定总糖及还原糖的含量。并利用回归方程得到落叶松样品中总糖含量及还原糖含量,按下列公式计算阿拉伯半乳聚糖的含量[14]。

阿拉伯半乳聚糖含量=总糖含量-还原糖含量

阿拉伯半乳聚糖得率(%)=(阿拉伯半乳聚糖质量/落叶松木粉质量)×100

1.2.4单因素实验设计以提取温度、闪提时间、料液比、提取时间四个因素为研究对象,以落叶松阿拉伯半乳聚糖得率为指标,进行单因素实验。

1.2.4.1提取温度对得率的影响分别准确称取落叶松木粉10.0 g,闪提时间1 min,料液比1∶15,提取时间30 min,在提取温度为35、45、55、65、75、85 ℃下分别提取。进行三次平行实验,比较结果确定最佳提取温度。

1.2.4.2闪提时间对得率的影响分别准确称取落叶松木粉10.0 g,以提取温度45 ℃,料液比1∶15,提取时间30 min,在闪提时间依次0、0.5、1、1.5、2 min分别提取。进行三次平行实验。比较结果确定最佳闪提时间。

1.2.4.3料液比对得率的影响分别准确称取落叶松木粉10.0 g,以提取温度45 ℃,闪提时间1 min,提取时间30 min,在料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30下提取。进行三次平行实验。比较结果确定最佳提取料液比。

1.2.4.4提取时间对得率的影响分别准确称取落叶松木粉10.0 g,以提取温度45 ℃,闪提时间1 min,料液比1∶15,在提取时间为0、20、40、60、80、100 min,分别提取。进行三次平行实验。比较结果确定最佳提取时间。

1.2.5响应面实验设计在单因素实验的基础上,根据响应面实验设计原理,运用Design Expert 8.0.6软件程序,根据 Box-Behnken 中心组合实验设计原理,采用四因素三水平的响应面分析法,以A(提取时间)、B(料液比)、C(提取温度)、D(闪提时间)为自变量,以阿拉伯半乳聚糖的得率为响应值,通过响应曲面分析(response surface analysis,RSA)对提取条件进行优化。实验因素及水平见表1。

表1　响应面实验因素与水平对照表

按照响应面设计实验得出的最优组合进行阿拉伯半乳聚糖的提取,计算得率。

1.2.6阿拉伯半乳聚糖的性质分析

1.2.6.1阿拉伯半乳聚糖的表观性质分析在扫描电子显微镜(SEM)设备下观察冷冻干燥后的阿拉伯半乳聚糖的表面形态。检测前,使用溅射镀膜机对材料表面进行喷金,扫描电镜采用10 kV的加速电压。

1.2.6.2阿拉伯半乳聚糖的红外光谱分析取少量样品置于红外光谱仪中进行测定,Spectrum 100型FT-IR Spectrometer红外光谱仪对阿拉伯半乳聚糖及单糖标准品进行红外测定,扫描分辨率2 cm-1,扫描范围为4000～400 cm-1,并对样品和单糖标准品的光谱结果进行比对鉴定。

1.3数据处理

分别采用Microsoft Excel(Office 2007)软件、Design Expert 8.0.6软件进行数据整理与分析。

2　结果与分析

2.1标准曲线制作

2.1.1总糖标准曲线制作得到总糖标准曲线,如图1所示,得到回归方程:C=11.239A-0.0769(R2=0.9950)。

图1　总糖标准曲线Fig.1　Standard curve of total sugar

2.1.2还原糖标准曲线制作得到还原糖标准曲线,如图2所示,回归方程C=12.393A-0.0313(R2=0.9992)。

图2　还原糖标准曲Fig.2　Standard curve of sugar

2.2单因素实验结果

2.2.1提取温度的选择提取温度对阿拉伯半乳聚糖得率的影响如图3所示。实验结果表明,随着提取温度的升高,阿拉伯半乳聚糖得率逐渐增大,在55 ℃以下增长速率较迟缓,55～65 ℃得率增长较快,65 ℃以后得率几乎不变。由于目标提取物是一种活性多糖,为了避免温度过高而使其失去生物活性,同时为了减少杂质的溶出,因此,选择65 ℃为最佳提取温度。

图3　温度对阿拉伯半乳聚糖提取得率的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on extraction yield of arabinogalactan

2.2.2闪提时间的选择不同闪提时间对阿拉伯半乳聚糖得率的影响如图4,加入水后立即取样与闪提后立即取样两个数据结果得出闪提能够显著增加阿拉伯半乳聚糖的得率。随着闪提时间的增长,阿拉伯半乳聚糖得率不断上升,在闪提时间为1.5 min时得率最高,之后得率变化不大,这说明目标产物几乎完全提出。因此,在保证目标产物完全浸出的情况下,闪提时间越小越好,故本实验选取1.5 min为最佳闪提时间。

图4　闪提时间对阿拉伯半乳聚糖提取得率的影响Fig.4　Effect of flash-extraction time on extraction yield of arabinogalactan

2.2.3料液比的选择料液比对阿拉伯半乳聚糖得率的影响如图5。随着料液比的增大,阿拉伯半乳聚糖不断上升,在料液比为1∶15时,得率最高,继续增大料液比对得率影响不大。因此选取1∶15为最佳料液比。

图5　料液比对阿拉伯半乳聚糖提取得率的影响Fig.5　Effect of ratio of solid to liquid on extraction yield of arabinogalactan

图6　提取时间对阿拉伯半乳聚糖提取得率的影响Fig.6　Effect ofratio of extraction time on extraction yield of arabinogalactan

2.2.4提取时间的选择提取时间对阿拉伯半乳聚糖得率的影响如图6。随着提取时间的增长,阿拉伯半乳聚糖得率增加不明显,这可能是由于闪提能够显著提高阿拉伯半乳聚糖的得率,之后再搅拌提取对其得率影响不大,在搅拌20 min时,得率最高,随着搅拌时间的增长,得率增加不明显,考虑到实际应用中节约成本,提取时间越短越好,故本实验选取最佳提取时间为20 min。

2.3响应面分析结果

2.3.1响应面模型回归分析以A(提取时间)、B(料液比)、C(提取温度)、D(闪提时间)为变量,以阿拉伯半乳聚糖的提取得率为响应值,按响应面软件Design Expert 8.0.6 提供设计的组合进行实验,得到结果见表2。

表2　响应面设计方案及结果

采用Design Expert 8.0.6软件,对表2中的实验数据进行回归分析,得出阿拉伯半乳聚糖得率的回归方程如下:Y=13.85+0.10A+0.082B+0.81C+0.042D-0.077AB-0.038AC+0.050AD-0.022BC+0.020BD-0.010CD-0.22A2-0.25B2-0.39C2-0.096D2。其决定系数R2=0.9893,说明回归方程适用于阿拉伯半乳聚糖的理论预测值。对回归方程做显著性检验与方差分析,结果见表3。

通过表3可以直观看到,模型显著性检验为极显著,p<0.0001,失拟项p为 0.3010>0.05,说明该模型与实验拟合度良好。模型的二次项A2、B2、C2和一次项C达到极显著水平,p<0.0001;一次项A和B达到高度显著水平,p<0.01;另外二次项D2达到显著水平,p<0.05。通过对Y的回归系数的检验可知,各因素对阿拉伯半乳聚糖得率影响的大小顺序为:提取温度(C)>提取时间(A)>料液比(B)>闪提时间(D)。

图7　阿拉伯半乳聚糖样品的扫描电镜图Fig.7　Scanning picture of arabinogalactan by SEM

2.3.2优化提取工艺条件的确定经过软件优化得到的提取工艺为,提取温度为70 ℃,闪提时间为1.61 min,料液比为1∶15.52(g/mL),提取时间21.52 min,优化预测的得率值14.2838%。经实验检验,此时得到的阿拉伯半乳聚糖的实际得率14.32%,与理论预测值接近,证明该回归模型具有可靠性。为了实际的操作方便,将阿拉伯半乳聚糖的提取工艺参数修正为:提取温度为70 ℃,闪提时间为1.6 min,料液比为1∶16(g/mL),提取时间为22 min,并在此工艺参数条件下进行三次平行实验,实际测得阿拉伯半乳聚糖的得率为14.30%±0.05%,与预测值相差很小,说明该模型与实际拟合度良好,用于预测实验结果比较可靠,具有实用价值。

2.4样品的电镜扫描分析

扫描电镜结果可直接观察试样的表面形貌,图像具有整体的立体感。在低倍镜下,可观察试样表面凹凸不平,颗粒大小不一,较小颗粒依附在较大颗粒周围,试样表面带有小孔洞,呈蜂窝状。在较高倍镜下,可以清楚地看见颗粒的形状,颗粒呈不规则的几何外形,表面平滑,颗粒彼此相互堆积在一起,在固体状态下多以大的聚集态存在。即使放大倍率也是光滑表面,没有清晰细节,不能获得多糖聚集体的微观形貌信息。关于落叶松多糖的结构还需要进一步分析。

表3　二次响应面回归模型方差分析

注:*表示具有显著性p<0.05;**表示具有高度显著性p<0.01，具极显著性p<0.001。

2.5阿拉伯半乳聚糖红外结果分析

图8　样品红外光谱图Fig.8　Infrared(IR)spectra of the samples

阿拉伯半乳聚糖样品的红外光谱图如图8所示,阿拉伯半乳聚糖标准品的红外光谱图如图9所示,阿拉伯半乳聚糖样品的红外光谱分析结果显示,3419.48 cm-1的宽强吸收峰是分子间氢键缔合的O-H的伸缩振动,2924.49 cm-1的吸收峰表明含有C-H的伸缩振动,两者是糖类的特征吸收峰,同时说明阿拉伯半乳聚糖中含有大量H键,1607.19 cm-1的吸收峰是C=O非对称伸缩振动,1400～1300 cm-1的一些吸收峰是C-H 变角振动,1300～670 cm-1为指纹区,1139.69 cm-1的吸收峰是C-O伸缩振动,947.23 cm-1的吸收峰是O-H弯曲振动,843.84 cm-1的吸收峰是α-端基差向异构体的C-H变角振动,指纹区吸收峰与标准品图谱的比较,可以得出定性结论。

根据指纹区吸收峰做定性分析,样品在指纹区的特征吸收频率有1139.69,995.15,947.23,843.84 cm-1,分别与标准品阿拉伯半乳聚糖在指纹区的特征吸收频率1134.15,994.47,946.14,844.62 cm-1相一致。指纹区域的样品吸收峰位置与标准品位置一致,结合以上官能团区域的分析,样品可定性为阿拉伯半乳聚糖。

图9　标准品红外光谱图Fig.9　Infrared(IR)spectra of the standards

3　结论

本实验采用闪式提取法,并通过响应面实验设计原理得出了落叶松中阿拉伯半乳聚糖闪式提取的优化工艺。得到最佳提取工艺参数为:温度70 ℃,闪提时间1.6 min,料液比1∶16,提取时间22 min。此条件下阿拉伯半乳聚糖的提取率为14.30%±0.05%。利用电镜扫描观察落叶松阿拉伯半乳聚糖样品,发现其基本呈不规则几何形状分布。以阿拉伯糖及半乳糖标准品作为对比,对落叶松阿拉伯半乳聚糖样品进行红外光谱分析,样品出现糖类的特征吸收峰,并且根据指纹区吸收峰做定性分析,样品在指纹区的特征吸收频率与标准品相一致,可定性为阿拉伯半乳聚糖。

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Optimization of flash-extraction of larch arabinogalactan using response surface analysis and its characterization

CHEN Yuan1,LI Jian-xia2,ZHU Rui-qian1,SUN Meng-meng1,DONG Jie-qiong1,WANG Jian-zhong1,*

(1.College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.School of Nature Conservation,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

The North China larch was used as the raw material to extract larch arabinogalactan by flash-extraction,based on single factor experiments,extraction condition was optimized by the response surface analysis. The results showed that the optimal conditions of extraction of the larch arabinogalactan from the North China larch were as follows:extraction temperature 70 ℃,flash-extraction time 1.6 min,solid-to-liquid(g/mL)ratio 1∶16 and extraction time 22 min. Under this condition,the maximal content of larch arabinogalactan was up to 14.30%±0.05%. By using scanning electron microscopy(SEM)analysis of the arabinogalactan samples,it was found that its distribution was the irregular geometry. And the infrared spectrum(IR)analysis showed that it contained a typical groups of saccharide compounds,also its trend was almost consistent with the standards.

larch;arabinogalactan;flash-extraction;SEM;IR

2015-09-08

陈苑(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：天然产物提取，E-mail：zicheny2004@163.com。

王建中(1952-)，男，教授，研究方向：林产品加工利用，E-mail：w62338221@163.com。

林业公益性行业科研专项(201004081)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0306-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.049