白鲢鱼皮明胶的脱脂方法及其脱脂前后理化特性的研究

郑海旭,侯　虎,牛慧娜,陈铁军,李八方

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)



白鲢鱼皮明胶的脱脂方法及其脱脂前后理化特性的研究

郑海旭,侯虎,牛慧娜,陈铁军,李八方*

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

为了探究白鲢鱼皮是水产明胶的良好来源,得到低脂肪含量的白鲢鱼皮明胶,本实验研究了白鲢鱼皮的基本成分,白鲢鱼皮明胶的脱脂方法,并对其脱脂前后的理化特性进行对比。通过国标等方法对白鲢鱼皮进行基本成分分析,采用热水提取法制备白鲢鱼皮明胶并添加四种不同型号大孔树脂(D101、X-5、XAD1180、AB-8)以静态吸附的方式对明胶溶液进行脱脂处理。结果表明:白鲢鱼皮富含蛋白质、矿物质元素等,可作为水产明胶的良好来源;经D101型树脂在40 ℃、树脂添加量为10%的条件下处理的明胶溶液,脱脂效果最佳,脱脂率达到78.94%±2.98%;羟脯氨酸含量由6.77%±0.09%上升到7.17%±0.13%;脱脂前后明胶的紫外光谱均在221 nm处出现最大吸收峰;SDS-PAGE电泳图谱均主要由β,α1,α2三条肽链组成;红外光谱图的趋势基本相同,均具有胶原的典型官能团;脱脂后明胶的凝胶强度较脱脂前略有降低;脱脂后的明胶粘度较脱脂前有所增大;脱脂后的明胶中Ca、Mg、Zn含量较脱脂前分别增加了75.96%、284.13%和2.68%,但Cu、Fe、Mn含量较脱脂前分别降低了16.67%、48.11%和15.56%。

白鲢鱼皮，明胶,大孔树脂,脱脂,羟脯氨酸,理化性质

明胶是一种具有优良生物学特性的变性胶原蛋白[1],主要涉及食品,制药,化妆品,照相明胶等众多工业领域[2]。近年来,明胶的全球需求量不断增长,尤其是在亚洲。然而疯牛病、口蹄疫等传染病的发生以及宗教信仰等问题严重限制了这些陆地牲畜作为胶原原料的应用[3]。因此,寻找猪、牛皮和骨以外的明胶提取原料显得尤为迫切。水产动物中,特别是鱼皮,可能会成为哺乳动物明胶的良好替代产品。

白鲢鱼(silver carp)是我国主要的淡水鱼种,年产量约为352.48万吨。在加工过程中产生的大量鱼皮,鱼鳞和鱼骨等废弃物,不仅导致环境污染,还导致资源浪费[4]。从富含胶原蛋白的废弃鱼皮中提取明胶就是一种对水产品废弃物高值化利用的有效手段。

明胶中的脂肪含量是评定明胶品质的重要指标之一。脂肪含量过高会显著影响明胶的色泽及透明度[5],油脂中的腥味成分也会影响明胶的风味,脂肪含量亦会影响明胶产品的粘度、凝胶强度等理化特性,降低产品品质。因此,对脂肪进行有效脱除成为明胶加工及应用领域亟待解决的问题。

以往的明胶脱脂一般是指对提取原料进行脱脂。常用的脱脂方法主要有皂化法、有机溶剂法、浸酸法等[6]。本实验采用常应用于中药制药工艺中且安全、有效、操作简单的物理吸附材料——大孔树脂,直接对白鲢鱼皮明胶溶液进行处理。通过在白鲢鱼皮明胶溶液中添加不同质量分数的大孔树脂,探究最佳脱脂效果及胶原的特征氨基酸——羟脯氨酸的含量损失情况,并对比脱脂前后的白鲢鱼皮明胶的理化性质。为明胶溶液的脱脂提供新方法,且为得到高纯度、高感官品质的低脂白鲢鱼皮明胶提供实验依据及理论支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

白鲢鱼购于青岛市南山水产品市场,取鱼皮,-20 ℃冷冻保存;D101,XAD1180,X-5型大孔树脂购自北京索莱宝试剂有限公司;AB-8型大孔树脂购自南开大学化工厂;甘油三酯试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

AL204型电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司;SHA-B型恒温振荡器国华电器有限公司;RE52CS型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂;Alpha1-4LD型冷冻干燥机德国Christ公司;UV-2401PC型紫外可见分光光度计日本岛津公司;DYY-6C型电泳仪北京市六一仪器厂;Nicolet-200SXV傅立叶红外光谱仪美国Nicolet公司;TMS-Pro物性分析仪美国FTC公司;MCR 101型流变仪安东帕科学仪器有限公司;VISTA-MPX电感耦合等离子体原子发射光谱仪美国瓦里安有限公司。

1.2实验方法

1.2.1白鲢鱼皮基本成分分析水分含量参照GB/5009.3-2010测定;蛋白质含量参照GB/5009.5-2010测定;脂肪含量采用Bligh-Dyer法测定[7];灰分含量参照GB/5009.4-2010测定;总糖含量参照GB/T9695.31-2008测定;羟脯氨酸含量测定采用氯胺T法[8];矿物质成分采用ICP-AES进行测定。

1.2.2白鲢鱼皮明胶的提取[9]白鲢鱼皮室温下解冻,用滤纸吸干鱼皮表面多余水分,并将鱼皮剪成约1 cm×1 cm大小。采用热水法提取白鲢鱼皮明胶。将处理好的白鲢鱼皮在0.01 mol/L柠檬酸溶液中浸泡约15 min使其溶胀,反复水洗鱼皮至中性,按料液比1∶6(w∶v)加入蒸馏水,70 ℃水浴搅拌提取2 h,绢纱过滤后进行旋蒸浓缩,-50 ℃、0.1 MPa下冷冻干燥,即得到白鲢鱼皮明胶,备用。

1.2.3大孔树脂的选择根据非极性树脂及弱极性树脂的表面疏水性较强,适用于极性溶剂中吸附非极性物质的特点,本实验选取了三种非极性树脂(D101、X-5、XAD1180)及一种弱极性树脂(AB-8),对明胶溶液中的非极性脂质进行吸附。

1.2.4大孔树脂预处理[10]将大孔树脂以0.5 BV 95%乙醇浸泡24 h,蒸馏水反复洗净至无醇味。以2 BV 4% HCl浸泡2～4 h,水洗至中性。以2 BV 4% NaOH浸泡2～4 h,水洗至中性,湿基保存,备用。

1.2.5大孔树脂静态吸附实验在浓度为20 mg/mL的白鲢鱼皮明胶溶液中加入不同型号(D101、X-5、XAD1180、AB-8)及添加量(2%、5%、10%、15%、20%)的大孔树脂,40 ℃水浴下搅拌1.5 h,6000 r/min离心15 min,取上清液,-50 ℃、0.1 MPa下冷冻干燥得到低脂白鲢鱼皮明胶。

1.2.6白鲢鱼皮明胶脂肪含量的测定以白鲢鱼皮明胶中甘油三酯含量计脂肪含量,采用甘油三酯试剂盒进行测定。

脱脂率(%)=[(脱脂前的脂肪含量-脱脂后的脂肪含量)/脱脂前的脂肪含量]×100

1.2.7白鲢鱼皮明胶理化性质的测定

1.2.7.1白鲢鱼皮明胶的羟脯氨酸含量测定采用氯胺T法对白鲢鱼皮明胶中的羟脯氨酸含量进行测定[8]。

1.2.7.2紫外吸收光谱扫描配制浓度为0.5 mg/mL的白鲢鱼皮明胶溶液,用紫外分光光度计在200～400 nm近紫外光区以100 nm/min进行扫描,扫描精度为0.5 nm。

1.2.7.3聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳参考Laemmli[11]的方法分析明胶样品,采用7.5%的分离胶和5%的浓缩胶,样品浓度为2 mg/mL与SDS上样缓冲液1∶4混合,上样量为20 μL;采用直流恒压电源,电压为 100 V,电泳2～3 h。染色液染色20 min后脱色处理。用凝胶成像系统对脱色后的明胶进行紫外透射拍照。

1.2.7.4傅立叶红外光谱分析将冻干的明胶与干燥后的KBr置于玛瑙研钵中磨成均匀粉末状,适量装样,手动压片,采用傅立叶红外光谱仪对样品在 4000～500 cm-1扫描,分辨率为 2 cm-1。

1.2.7.5凝胶强度的测定配制6.67%的明胶水溶液,4 ℃条件下陈化16～18 h,确保明胶在温度8～9 ℃下被测定。设定程序条件参数:r=6.35 mm的圆柱状平头冲头,下压高度为4 mm,速度为1 mm/s。

表1　白鲢鱼皮基本成分

1.2.7.6粘度的测定将10 mg明胶样品溶于10 mL蒸馏水中,采用流变仪在15～45 ℃之间检测样品粘度。

1.2.7.7矿物质成分测定将0.5 g明胶样品加入到消化瓶中,并加入6 mL硝酸,将消化瓶置于电炉上进行湿法消化,直至消化液透明。冷却后,定溶至50 mL,备用。采用ICP-AES进行测定。

1.2.8数据分析实验数据采用SPSS19.0软件进行处理,数据以平均值±标准偏差表示。

2　结果与分析

2.1白鲢鱼皮基本成分

由表1可知白鲢鱼皮的水分含量为61.4%±1.55%。在白鲢鱼皮干物质中主要成分为蛋白质,约占71.80%±0.41%,羟脯氨酸含量可达6.82%±0.95%,这说明白鲢鱼皮是一种较好的胶原蛋白的水产品加工原料。然而其高脂肪含量却对高品质白鲢鱼皮明胶的提取造成了不良影响。

2.2白鲢鱼皮矿物质组成(ICP-AES)

由表2可知,被检测的八种矿物质中白鲢鱼皮含有六种,其中Ca、Zn、Mg、Fe含量较高,这可能与白鲢鱼生长的淡水环境有关,说明白鲢鱼皮具有较高的应用价值。Cd和Pb两种元素未检测到,显示了白鲢鱼皮的安全性。并且白鲢鱼皮富含矿物质这一事实也为提取富含矿物质的白鲢鱼皮明胶提供可靠依据。

表2　白鲢鱼皮矿物质含量(μg/g)

2.3大孔树脂对白鲢鱼皮明胶脱脂效果的影响

由图1(A，B，C)可知,D101、X-5、XAD1180型大孔树脂添加量在2%～10%之间,脱脂率均呈上升趋势,且添加量为10%时可达到最大脱脂率,分别为78.94%±2.98%、69.46%±4.47%、64.19%±2.98%,当树脂添加量在10%～20%之间时,脱脂率均呈下降趋势。由图1D可知,AB-8型大孔树脂的添加量在2%～15%之间,脱脂率呈上升趋势,添加量为15%时,脱脂率达到最高68.40%±8.94%。这说明了一定添加量的大孔树脂可对白鲢鱼皮明胶溶液起到良好的脱脂效果。

羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸,其含量可反映胶原蛋白的含量变化,从而间接反映了明胶的纯度。经实验测得,脱脂前的明胶羟脯氨酸含量为6.77%±0.09%。由图1A可知,D101型大孔树脂添加量为10%时,明胶中羟脯氨酸含量最高,为7.17%±0.13%,而添加量为5%和15%时,明胶中的羟脯氨酸均有损失,低于脱脂前。由图1B可知,羟脯氨酸含量随着X-5型大孔树脂添加量的增加呈现先增加后减少的趋势,当添加量为10%时,羟脯氨酸含量达到最高,为7.65%±0.01%。由图1C可知,羟脯氨酸含量随着XAD1180型大孔树脂添加量的增加呈现先增加后减少的趋势,且添加量为2%、5%和10%时,羟脯氨酸含量均高于脱脂前,添加量为15%和20%时,羟脯氨酸含量低于脱脂前。由图1D可知,羟脯氨酸含量随着AB-8型大孔树脂添加量的增加呈现先增加后减少的趋势,当添加量为15%时,羟脯氨酸含量达到最高,为6.99%±0.14%。由此可知,一定添加量的大孔树脂可对明胶溶液起到浓缩的作用,提高了明胶的纯度,并且使得明胶溶液颜色更加澄清透明。因此,本实验选取脱脂率最高的明胶(经添加量为10%的D101型大孔树脂脱脂处理后的明胶)作为后续理化性质研究的对象。

2.4白鲢鱼皮明胶脱脂前后的理化性质研究

2.4.1紫外吸收光谱分析结果脱脂前后对白鲢鱼皮明胶溶液的紫外吸收光谱的影响如图2所示。大多数蛋白质在280 nm处会出现紫外强吸收峰,这是由于色氨酸的存在导致的。然而不同于大多数蛋白,明胶中几乎不含有色氨酸,因此不会在280 nm处出现紫外强吸收峰。脱脂前后的白鲢鱼皮明胶均在221 nm处显示了最强紫外吸收峰,说明明胶肽链分子中存在酰胺键[12]。这与资料报道的胶原蛋白吸收峰位置(225 nm)一致[13],说明脱脂处理并未对白鲢鱼皮明胶的紫外吸收光谱有影响。

图2　白鲢鱼皮明胶脱脂前后的紫外吸收光谱Fig.2　Ultraviolet absorption spectroscopy of gelatin from silver carp skin

2.4.2聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳结果由图3可知,脱脂前后的白鲢鱼皮明胶的电泳图谱没有显示明显差异,这说明D101型大孔树脂处理并没有影响明胶的结构。两种明胶均主要包含β、α1、α2三条肽链和少量的γ链,分子量大约在105～250 ku之间,具备典型的Ⅰ型胶原蛋白特征。白鲢鱼皮明胶至少含有两条α链(α1和α2),这是因为α1与α3在SDS-PAGE胶上无法辨别[14]。此外,还可以看出,热水法所提取的白鲢鱼皮明胶中出现了低分子条带,这可能是因为在提取过程中,热水的作用使部分胶原降解成了小分子组分。

图3　白鲢鱼皮明胶脱脂前后的SDS-PAGE电泳图Fig.3　SDS-PAGE electrophoresis pattern of gelatin from silver carp skin注:1.蛋白标准品;2.脱脂前白鲢鱼皮明胶;3.脱脂后白鲢鱼皮明胶。

图4　白鲢鱼皮明胶脱脂前后的红外光谱图Fig.4　Infrared spectra of gelatin from silver carp skin

2.4.3红外光谱分析结果由图4可以看出,脱脂前后的白鲢鱼皮明胶的红外光谱趋势基本相同。一般而言,在红外光谱中N-H基团伸缩振动产生的酰胺A的吸收通常在3400～3440 cm-1处,当含有N-H基团的分子肽段参与氢键的形成时,N-H的伸缩振动会向低频率移动,通常在3300 cm-1左右[15]。由图4可以看到,脱脂前后的白鲢鱼皮明胶中酰胺A的吸收峰出现在3228.37 cm-1左右,表明了蛋白分子中存在氢键。氨基酸之间含有大量肽键,而羰基键的伸缩振动导致酰胺Ⅰ带的特征吸收波数通常在1625～1690 cm-1[16],酰胺键为蛋白质二级结构变化的敏感的官能团,常被用于蛋白质的二级结构分析。脱脂前后的白鲢鱼皮明胶的酰胺Ⅰ带的吸收峰在1654.55 cm-1左右,结果符合酰胺Ⅰ带的出峰位置。两种明胶的红外图谱显示在1237.32 cm-1左右处均出现吸收峰,表明脱脂前后的明胶均有酰胺Ⅲ带存在[17]。

2.4.4凝胶强度测定结果凝胶强度是衡量明胶品质的重要指标之一,影响凝胶强度的因素有很多,比如原料、提取工艺条件、明胶中羟脯氨酸含量等有关。一般来说,明胶的羟脯氨酸含量越高,凝胶强度也就越高。本实验中脱脂前的明胶羟脯氨酸含量为6.77%±0.09%,脱脂后为7.17%±0.13%,但由图5可以看出,脱脂后白鲢鱼皮明胶凝胶强度(35.02±4.41)N/mm2反而比其脱脂前(40.28±1.18)N/mm2要低,这可能是因为脱脂前的白鲢鱼皮明胶中含有疏水性的脂类所引起。

2.4.5粘度测定结果由图6可知,两种明胶的粘度均随着温度的升高而平稳的降低,且脱脂后的白鲢鱼皮明胶的粘度大于脱脂前。蛋白质中的氨基酸组成、分子量及蛋白分子的多分散性等诸多因素均影响着明胶溶液的粘度,当明胶中的羟脯氨酸含量较多时,其粘度较大[18]。而脱脂后的明胶中羟脯氨酸含量较脱脂前有所升高,这使明胶的浓度得到增加,此时明胶溶液分子内和分子间的氢键作用增强,从而粘度增大。因此,经D101型大孔树脂脱脂后的明胶纯度提高。

表3　白鲢鱼皮明胶矿物质含量(μg/g)

图5　白鲢鱼皮明胶脱脂前后的凝胶强度Fig.5　Gel strength of gelatin from silver carp skin注:1.脱脂前白鲢鱼皮明胶;2.脱脂后白鲢鱼皮明胶。

图6　白鲢鱼皮明胶脱脂前后的粘度Fig.6　Viscosity of gelatin from silver carp skin

2.4.6矿物质含量由表3可知,白鲢鱼皮明胶富含多种矿物质元素。被检测的8种元素中,Ca、Zn、Mg、Fe含量较高,其中脱脂后白鲢鱼皮明胶的Ca和Mg含量明显高于脱脂前,分别增加了75.96%和284.13%,脱脂后Zn含量略高于脱脂前,增加了2.68%。脱脂后Cu、Fe、Mn含量较脱脂前有所降低,分别降低了16.67%、48.11%和15.56%。Cd和Pb两种元素未检测到。综上所述,脱脂前后的白鲢鱼皮明胶均含有丰富的矿物元素,但含量各有差异。

3　结论

白鲢鱼皮营养成分丰富,是水产胶原蛋白的良好来源。D101型大孔树脂添加量为10%时对白鲢鱼皮明胶溶胶的脱脂效果最好,脱脂率达到78.94%±2.98%,羟脯氨酸含量由6.77%±0.09%上升到7.17±0.13%。对比其与脱脂前的白鲢鱼皮明胶理化性质,结果表明:低脂明胶的紫外光谱、SDS-PAGE电泳图谱及红外光谱均没有明显变化;脱脂前明胶的凝胶强度略高于脱脂后;低脂明胶的粘度大于脱脂前;脱脂后的明胶中Ca、Mg、Zn含量较脱脂前分别增加了75.96%、284.13%和2.68%,Cu、Fe、Mn含量较脱脂前分别降低了16.67%、48.11%和15.56%。以上结果说明脱脂并未影响明胶的结构,且提高了明胶品质。

[1]Wynnyckyj C,Omelon S,Willett T L,et al.Mechanism of bone collagen degradation due to KOH treatment[J].Biochimica et

Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,2011,1810(2):192-201.

[2]Duan R,Zhang J,Xing F,et al.Study on the properties of gelatins from skin of carp(Cyprinuscarpio)caught in winter and summer season[J].Food Hydrocolloids,2011,25(3):368-373.

[3]杨树奇,曾少葵,周春霞,等.3种鱼皮的基本成分及氨基酸组成分析[J].广东海洋大学学报,2010,30(1):97-100.

[4]Zhang J,Duan R,Wang Y,et al.Seasonal differences in the properties of gelatins extracted from skin of silver carp(Hypophthalmichthysmolitrix)[J].Food Hydrocolloids,2012,29(1):100-105.

[5]田昌林,鲍忠剑,田文儒.丙酮法和碱法脱脂对胶原蛋白生产的影响[J].动物医学进展,2007,28(4):43-47.

[6]王雅卿,郭恒斌,曾庆祝.鲤鱼脱脂方法的研究[J].水产科学,2006,25(6):297-300.

[7]Bligh E G,Dyer W J.A rapid method of total lipid extraction and purification[J].Canadian Journal of Biochemistry and Physiology,1959,37(8):911-917.

[8]Bergman I,Loxley R.Two improved and simplified methods for the spectrophotometric determination of hydroxyproline[J]. Analytical Chemistry,1963,35(12):1961-1965.

[9]Arnesen J A,Gildberg A. Extraction and characterization of gelatine from Atlantic salmon(Salmo salar)skin[J]. Bioresource Technology ,2007,98:53-57.

[10]贾存勤,李阳春,屠鹏飞,等.D-101型大孔吸附树脂预处理方法的研究[J].中草药,2006,37(2):193-196.

[11]Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227(5259):680-685.

[12]Chandra M V,Shamasundar B A.Rheological properties of gelatin prepared from the swim bladders of freshwater fish Catla catla[J].Food Hydrocolloids,2015,48:47-54.

[13]李彦春,程宝箴,靳立强.胶原蛋白的应用[J].皮革化工,2001,19(3):10-14.

[14]Kimura S. Wide distribution of the skin type Ⅰ collagenα3 chain in bony fish[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,1992,102:255-260.

[15]Li H,Liu B L,Gao L Z,et al. Studies on bullfrog skin collagen[J]. Food Chemistry,2004,84:65-69.

[16]段蕊,张俊杰,陈玲,等. 鲤鱼鱼皮和鱼骨酶溶性胶原蛋白的性质比较[J]. 食品与发酵工业,2008,34(5):10-13.

[17]张强,王倩倩,陆剑锋,等.不同方法提取鲢鱼皮胶原蛋白的理化特性比较[J].现代食品科技,2014,30(5):104-110.

[18]Sarabia A I,Gómez-Guillén M C,Montero P.The effect of added salts on the viscoelastic properties of fish skin gelatin[J].Food Chemistry,2000,70(1):71-76.

Research on degreasing methods and physical-chemical characteristics with degreasing before and after of gelatin from silver carp skin

ZHENG Hai-xu,HOU Hu,NIU Hui-na,CHEN Tie-jun,LI Ba-fang*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to explore whether silver carp skin was a kind of good sources of gelatin or not,and to obtain gelatin from silver carp skin with low-fat,the degreasing methods for gelatin were investigated,and the physical and chemical characteristics of the gelatin with degreasing before and after were compared. The basic ingredients of silver carp skin were comprehensive analyzed. The gelatin of silver carp skin was extracted by hot water. Then made degreasing treatments with four kinds of macroporous resins(D101,X-5,XAD1180,AB-8)by the way of static adsorption. The results were obtained as follows:silver carp skin were rich in protein and minerals and could be used as a kind of good sources of aquatic gelatin;The rate of degreasing can be reached at 78.94%±2.98%,the hydroxyproline content rose from 6.77%±0.09% to 7.17%±0.13% after treated with D101 in the gelatin solution when temperature was 40 ℃,resin amount was 10%. UV and FT-IR measurements of gelatin without degrease and gelatin with degrease were quite similar,and all of them showed maximum absorption peak at 221 nm. SDS-PAGE pattern indicated that both of them containedβ,α1andα2chains. Gel strength of gelatin without degreasing was light higher than that of gelatin with degreasing. However,the viscosity of gelatin with degreasing was higher than that of gelatin without degreasing. Compared with the gelatin without degreasing,the contents of Ca,Mg and Zn in gelatin with degreasing were increased by 75.96%,284.13% and 2.68%,respectively,while the contents of Cu,Fe and Mn in gelatin with degreasing were decreased by 16.67%,48.11% and 15.56%,respectively.

silver carp skin;gelatin;macroporous resins;degrease;hydroxyproline;physical-chemical characteristics

2015-11-27

郑海旭(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：食品加工与功能食品及水产品高值化利用，E-mail:hlehx2008@163.com。

李八方(1953-),男，教授，研究方向:海洋生物活性物质及功能性食品，E-mail:bfli@ouc.edu.cn。

国家自然科学基金面上项目(31471606,31401476)；山东省海洋经济创新发展区域示范项目；海洋公益性行业科研专项(201105029)。

TS254.9

B

1002-0306(2016)12-0278-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.044