广州地区淋球菌耐药性的趋势分析

黎小东，梁景耀，毕　超，李　平，梁艳华，林路洋，王焕丽，张锡宝，曹文苓

(广州市皮肤病防治所检验科，广东广州 510095)



·论著·

广州地区淋球菌耐药性的趋势分析

黎小东，梁景耀，毕超，李平，梁艳华，林路洋，王焕丽，张锡宝，曹文苓△

(广州市皮肤病防治所检验科，广东广州 510095)

摘要:目的了解广州地区13年的产青霉素酶淋球菌(PPNG)和高水平耐四环素淋球菌(TRNG)的流行状况及对5种抗菌药物的耐药趋势。方法用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)以及用纸片碘量法检测β-内酰胺酶。结果1 324株淋球菌中，2000～2005年度PPNG检出率占23.5%(156/665)，2008～2014年度PPNG检出率占36.4%(240/659)，差异有统计学意义(P<0.05)。2000～2005年度TRNG检出率占33.4%(222/665)，2008～2014年度TRNG检出率占42.6%(281/659)，差异有统计学意义(P<0.05)。青霉素耐药率从71.1%(473/665)升高至87.1%(574/659)，差异有统计学意义(P<0.05)；环丙沙星耐药率由88.9%(591/665)升至98.0%(646/659)，差异有统计学意义(P<0.05)；头孢曲松中度敏感率从12.3%(82/665)提升到21.5%(142/659)，差异有统计学意义(P<0.05)；大观霉素未发现耐药菌。结论持续进行淋球菌耐药性监测非常重要，大观霉素在临床上可以作为治疗淋病的优选药物，具有良好疗效。

关键词:淋球菌；最低抑菌浓度；耐药性

随着国内抗菌药物的大量使用和时间的推移，淋球菌对抗菌药物的耐药性也有所不同。本所统一采用了世界卫生组织(WHO)西太区淋球菌耐药监测规划推荐的琼脂稀释法和药物敏感性判断标准进行监测[1-2]。

1材料与方法

1.1菌株来源本所从性病门诊患者的泌尿生殖道分泌物中分离得到1 324 株淋球菌，其中2000～2005年665株，2008～2014年659株，所有菌株经革兰染色、氧化酶试验和糖发酵试验证实后，传代一次后洗于脱脂牛奶中，于-78 ℃低温冰箱冻存备用。抗菌药物：青霉素、环丙沙星、四环素、头孢曲松和大观霉素由中国疾病预防中心性病控制中心提供。培养基：淋球菌(GC)基础培养基(OXOID 公司生产)加入10%脱纤维新鲜羊血。标准菌株：WHO标准淋球菌菌株A、B、C、D、E由中国疾病预防中心性病控制中心提供。

1.2方法

1.2.1菌悬液制备实验菌株和标准菌株用巧克力平板培养18～24 h 的淋球菌菌苔，用生理盐水制成107CFU/mL的菌悬液。

1.2.2最低抑菌浓度(MIC)测定采用WHO 西太区淋球菌耐药监测规划推荐的琼脂稀释法，具体如下。(1)先将5种抗菌药物按要求配成原液，再倍比稀释成不同的浓度。青霉素和环丙沙星是0.008～16 μg/mL 12个浓度；四环素16、8 μg/mL两个浓度；头孢曲松0.002～1 μg/mL 10个浓度；大观霉素2～128 μg/mL 7个浓度。(2)将3.7%GC基础琼脂高压灭菌，水浴冷却至50 ℃，加入脱纤维新鲜羊血(终浓度10%)。取0.2 mL倍比稀释好的5种抗菌药物工作液，加入20 mL GC血液基础培养基，混匀后倾倒平板。从低浓度至高浓度配制各种浓度的平板。用多头接种器将实验菌株和标准菌株菌悬液接种于各种浓度的平板，置36 ℃、5% CO2环境下培养36 h后观察结果，记录无菌落生长的MIC。以WHO的A、B、C、D、E标准菌株作质控。(3)WHO在2012年对头孢曲松、大观霉素有了新的判断标准[3]，各药物判断标准如下：青霉素和环丙沙星小于或等于0.03 μg/mL判为敏感(S)，0.06～0.50 μg/mL判为中度敏感(D)，≥1 μg/mL判为耐药(R)；头孢曲松MIC<0.125 μg/mL敏感，MIC≥0.125 μg/mL中度敏感，大观霉素MIC≤64 μg/mL敏感，MIC≥128 μg/mL耐药。产青霉素酶淋球菌(PPNG)是β-内酰胺酶阳性和耐四环素淋球菌(TRNG)是四环素MIC≤16 μg/mL。

1.2.3β-内酰胺酶测定采用纸片碘量法测定菌株的β-内酰胺酶，具体如下。取1 试管加入100 μL青霉素溶液(10 000 U/mL)，100 μL淀粉溶液(1%)，50 μL 碘试剂，呈蓝色混合物，在一滤纸条上滴50 μL 试剂，将一接种环培养物涂在蓝点上，放置1～2 min，如蓝色变成无色即为β-内酰胺酶阳性，颜色无变化则为阴性。每次试验以WHO E株作阳性对照，A株作阴性对照。

1.3统计学处理采用SPSS17.0进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

1 324株淋球菌中，2000～2005年度PPNG检出率占23.5%(156/665)，2008～2014年度PPNG检出率占36.4%(240/659),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。2000～2005年度TRNG检出率占33.4%(222/665)，2008～2014年度TRNG检出率占42.6%(281/659)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。青霉素耐药率从71.1%(473/665)升高至87.1%(574/659)；环丙沙星耐药率由88.9%(591/665)升至98.0%(646/659)；头孢曲松中度敏感率从12.3%(82/665)提升到21.5%(142/659)，差异有统计学意义(P<0.05)；大观霉素未发现耐药菌，详见表1。

表1　　2000～2005年和2008～2014年淋球菌的药敏结果

续表1　　2000～2005年和2008～2014年淋球菌的药敏结果

续表1　　2000～2005年和2008～2014年淋球菌的药敏结果

3讨论

淋球菌耐药性因时间和地区的不同而有所变化。本单位从1998年加入了中国区域的淋球菌耐药监测网，连续十几年收集菌株，按规定时间统一进行MIC测定。表1中2000～2005年度对青霉素的耐药率与2008～2014年度对青霉素的耐药率比较，差异有统计学意义(χ2=51.0，P<0.05)，与广州[3]、上海[4]、南京[5]等相关报道类似；而且从2001年开始，没有发现对青霉素敏感的菌株，2014年偶然出现1株敏感株。近几十年来，世界各地出现了越来越多对青霉素和四环素的耐药菌株，该药物已经不再作为治疗淋病的首选药物，但是PPNG/TRNG仍然作为淋球菌耐药监测的主要指标。从本研究结果显示，2008～2014年度PPNG检出率36.4%和TRNG检出率42.6%，较本单位于1998年淋球菌耐药监测的PPNG 3.2%和TRNG 1.6%上升了接近11.3倍以上[6]。2000～2005年度PPNG 23.5%和TRNG 33.4%与2008～2014年度比较差异有统计学意义(χ2=26.5，χ2=12.0，P<0.05)，与广州相关报道一致，1999～2001年PPNG从2%广泛迅速地升到21.8%[3]；上海地区PPNG 37.8%和TRNG 20.1%[4]。类似报道还有南京地区PPNG从8.0%～44.4%和TRNG从8%～32.8%[5]。而韩国PPNG从2000年64%下降到2006年21%，同时TRNG则从3%上升到9%[7]。2000～2009年加拿大PPNG从3.0%上升到9.0%，TRNG从3.4%下降到1.6%，呈递减趋势[8]。这些全球不同地域的不同变化，是否与临床有效的诊断、有效的抗菌药物治疗及性活动、性行为的变化有关系，有待进一步研究，从而提示了对青霉素、四环素进行追踪监测有重大意义。

十九世纪八十年代后期，喹诺酮类是治疗淋病的首选药物，但近二十多年，一些国家耐喹诺酮类药物的淋球菌株急剧出现。本次监测结果显示从2002年开始对环丙沙星耐药率高达93%以上，2000～2005年度从88.9%升至2008～2014年度的98.0%，差异有统计学意义(P<0.05)，耐药性非常高(MIC50≥8 μg/mL和MIC90≥32 μg/mL)。随时间推移，有连续报道中国的其他地方对环丙沙星耐药率有类似的增高[4-5]，因此，目前中国，环丙沙星不再作为治疗淋病的推荐药物，临床多数用第三代头孢菌素类治疗淋病。

与青霉素和环丙沙星对比，表中两个阶段没有发现对大观霉素耐药(MIC≥128 μg/mL)的菌株。在大观霉素敏感判断点MIC(64 μg/mL)附近，2000～2005年度没有出现淋球菌菌株，而2008～2014年度首次发现菌株40/559(7.2%该菌株在敏感范围)，预示着对大观霉素持续药物监测十分重要。尽管80年代中期，淋球菌对大观霉素的耐药菌株非常稀少，但一些国家还是有报道分离出少数耐药菌株，如1990～1998年的哥伦比亚、委内瑞拉[9]，2000年的越南、韩国和巴布亚新几内亚[10]，中国的广州(2/793)和南京(8/1 208)也有少数耐大观霉素药物的菌株报道[3-5]。WHO认为，当一种药物的耐药率超过5%时，该药物就不应该作为治疗该病的一线药物。然而，尽管中国及其他国家偶然检测到大观霉素耐药菌株，大观霉素仍然是有效药物，继续作为广州地区初次治疗淋病的首选药物，也是头孢菌素过敏患者治疗淋病的选择药物[11]。

中国没有报道头孢曲松临床治疗失效的案例，但头孢曲松MIC50、MIC90逐年增高，一些国家已经提出了一个重大的公共卫生问题——无法治愈淋病(“超级淋病”)。本资料显示头孢曲松MIC50(0.015 6～0.062 5 μg/mL)和MIC90(0.062 5～0.250 0 μg/mL)差异不明显，活性较强。头孢曲松的中度敏感率和MIC50、MIC90一样，都是值得关注的，中度敏感(MIC≥0.125 μg/mL)菌株，从2000～2005年度12.3%增至2008～2014年度21.5%，经χ2检验,差异有统计学意义(χ2=20.0，P<0.05)。头孢曲松中度敏感率与上海的分析结果相似11.9%[4]，但低于南京最近的报道32.9%[12]。此外，在2000～2005年值得关注的是对头孢曲松中度敏感的菌株已经超过5%，而2008～2014年度头孢曲松MIC 0.5 μg/mL 首次检测分离出6/559，提示了头孢曲松MIC值不断上升及广州地区淋球菌对头孢曲松可能耐药。一些国家建议加大头孢曲松的肌注剂量，以减缓淋球菌的头孢菌素耐药菌株扩散[13]。2007年，中国推荐使用单剂量250 mg头孢曲松进行肌肉注射作为淋病的首选治疗；借鉴国际组织指导方针建议和中国南京一样[12]，广州治疗淋病使用较高剂量(≥500 mg)头孢曲松肌注。

总之，广州地区淋球菌对青霉素和环丙沙星耐药，从2000～2005年度到2008～2014年度，耐药(PPNG和TRNG)迅速增加，没有发现头孢曲松耐药菌株，但对头孢曲松(MIC≥0.5μg/mL)和大观霉素(MIC≥64μg/mL)的高水平MIC值在第二年度首次出现，与海南地区类似[14]。

大观霉素活性仍然最强，具有良好临床疗效，可以作为治疗淋病的优选药物，因此，加强淋球菌耐药性的长期监测非常重要。

参考文献

[1]曹文苓,费实,武明昌,等.广州地区淋球菌对抗生素耐药性测定结果[J].临床皮肤科杂志,1999,4(28):223-224.

[2]Cao WL,Liang JY,Li XD,et al.Trends in antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae isolated from Guangzhou,China,2000 to 2005 and 2008 to 2013[J].Sexually Transmitted Diseases,2015,42(1):27-29.

[3]刁兴,郑和平,曹文苓,等.1996～2001年广州淋球菌耐药性和质粒介导耐药株流行趋势[J].中华皮肤科杂志,2002,35(6):467-469.

[4]Yang Y,Liao M,Gu WM,et al.Antimicrobial susceptibility and molecular determinants of quinolone resistance in Neisseria gonorrhoeae isolates from Shanghai[J].J Antimicrob Chemother，2006，58(1):868-872.

[5]Su X,Jiang F.Surveillance of antimicrobial susceptibilities in Neisseria gonorrhoeae in Nanjing,China,1999-2006[J].Sex Transm Dis,2007,34(1):995-999.

[6]曹文苓,黎小东,李嘉彦,等.淋球菌对五种抗生素的耐药性连续六年监测结果分析[J].中华检验医学杂志,2004,27(1):761-763.

[7]Lee H,Hong SG,Soe Y,et al.Trends in antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae isolated from Korean patients from 2000 to 2006[J].Sex Transm Dis,2011,38(1):1082-1086.

[8]Martin I,Sawatzky P,Allen V,et al.Emergence and characterization of Neisseria gonorrhoeae isolates with decreased susceptibilities to ceftriaxone and cefixime in Canada:2001-2010[J].Sex Transm Dis,2012,39(1):316-323.

[9]Dillon JR,Ruben M,Li H,et al.Challenges in the control of gonorrhea in South America and the Caribbean:monitoring the development of resistance to antibiotics[J].Sex Transm Dis,2006,33(1):87-95.

[10]The WHO Western Pacific Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme.Survemance of antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae in the WHO Western Pacific Region,2000[J].Commun Dis Intell，2001,25(4):274-276.

[11]Bignell C,Fitz GM.UK national guideline for the management of gonorrhea in adults J].STD AIDS,2011,22(10):541-547.

[12]Zhu BY,Yu RX,Yin Y,et al.Surveillance of antimicrobial susceptibilities of Neisseria gonorrhoeae in Nanning,China,2000 to 2012[J].Sex Transm Dis，2014，41(1):501-506.

[13]Unemo M,Nicholas RA.Emergence of multidrug-resistant,extensively drug-resistant and untreatable gonorrhea[J].Future Microbiol，2012，7(1):1401-1422.

[14]钟娜,郑文爱,王芳乾，等.2006～2011年海南地区淋球菌耐药性监测分析[J].中国皮肤性病学杂志,2013,27(1)：64-65.

Trends of antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae isolated from Guangzhou

LiXiaodong,LiangJingyao,BiCao,LiPing,LiangYanhua,LinLuyang,WangHuanli,ZhangXibao,CaoWenling△

(DepartmentofClinicalLaboratory,GuangzhouInstituteofDermatology,Guangzhou,Guangdong510095,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate,in the past thirteen years,the developing trends of resistance of Neisseria gonorrhoeae to 5 antibiotics and the prevalence of penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae (PPNG) and high level tetracycline resistant Neisseria gonorrhoeae (TRNG).MethodsMinimum inhibitory concentration (MIC) to ceftriaxone,spectiomycin,ciprofloxacin,and Penicillin were determined using the agar dilution method,and β-lactamase by paper iodine quantitative method.ResultsA total of 1 324 Neisseria gonorrhoeae isolates were studied,including 665 samples from 2000 to 2005 and 659 samples from 2008 to 2014.Between 2000-2005 and 2008-2014,the rates of PPNG and TRNG isolates significantly increased from 23.5%(156/665) to 36.4%(240/659),the difference was statistically significant(P<0.05) and from 33.4%(222/665) to 42.6%(281/659),the difference was statistically significant(P<0.05) respectively.The proportion of resistant strains to penicillin remarkably rose from 71.1%(473/665) to 87.1%(574/659),the difference was statistically significant(P<0.05).Like penicillin,the percentage of resistant strains to ciprofloxacin significantly increased from 88.9%(591/665) to 98.0%(646/659),the difference was statistically significant(P<0.05).Intermediate susceptible isolates to ceftriaxone increased from 12.3%(82/665) to 21.5%(142/659),the difference was statistically significant(P<0.05).No isolates resistant to spectinomycin were identified over the years.ConclusionThe study shows that it is important to strengthen the Neisseria gonorrhoeae surveillance of antimicrobial resistance as well as spectinomycin is successively as first drug of choice for treatment of Neisseria gonorrhoeae.

Key words:Neisseria gonorrhoeae;minimal inhibitory concentration;antimicrobial resistance

(收稿日期：2015-10-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.017

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)04-0472-04

作者简介：黎小东，女，副主任技师，主要从事微生物学和免疫学研究。△通讯作者，E-mail：CLLaz@163.com。