白首乌C21甾苷对慢性心力衰竭大鼠心肌的保护作用

惠　勇



白首乌C21甾苷对慢性心力衰竭大鼠心肌的保护作用

惠勇

【摘要】目的探讨白首乌C21甾苷对慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌的保护作用。方法采用Wistar大鼠建立CHF模型，随机分为4组：CHF模型组，给予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃；小剂量组，给予白首乌C21甾苷（0.5 g/kg）；中剂量组，给予白首乌C21甾苷（1.0 g/kg）；大剂量组，给予白首乌C21甾苷（2.0 g/kg） ；另设假手术组，给予等体积0.9%氯化钠注射液。3周后进行血流动力学、心脏指数、微血管密度（MVD）测量，分别采用Western blot和Real-Time PCR分析检测基质细胞衍生因子-1（SDF-1）蛋白和SDF-1mRNA的表达。结果白首乌C21甾苷中、大剂量组大鼠的左心室收缩压（LVSP）、平均左心室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax）明显高于CHF模型组，左心室舒张期末压（LVEDP）明显低于CHF模型组，左心室松弛时间常数（Tau）明显短于CHF模型组，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；白首乌C21甾苷剂量组大鼠的SDF-1蛋白及mRNA表达均明显高于CHF模型组，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论白首乌C21甾苷能有效改善CHF大鼠心功能，同时可促进新生血管形成，其机制可能与促进SDF-1表达有关。

【关键词】白首乌C21甾苷；慢性心力衰竭；基质细胞衍生因子-1

牡丹江市第二人民医院，黑龙江牡丹江157013

慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是一种复杂而常见的严重心脏功能障碍性疾病，具有发病率高、临床治疗困难、预后差和病死率高的特点，严重威胁人类的生命健康[1]。世界范围内大约有15 亿CHF患者，每年新增病例400万[2]。目前，CHF 是65岁以上老人住院的主要原因[3]。因此，寻找CHF安全有效的治疗方法或药物显得尤为重要。现代研究表明，白首乌中含有磷脂类、C21酯苷、黄酮类化合物、多糖类及微量元素等多种成分，具有明显的抗肿瘤、调节免疫和抗衰老等多种药理作用。白首乌C21甾苷能够清除超氧阴离子自由基和羟自由基，是白首乌中的主要活性成分[4]，但是其对CHF的影响鲜见报道。本研究就白首乌C21甾苷对CHF大鼠心肌的保护作用进行探讨，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物健康清洁级Wistar系大鼠70只，体重200～250 g，购于哈尔滨医科大学动物实验中心，实验动物合格证号为：P00102012，使用许可证号：SYXK（黑）2012-033。饲养于标准环境，自由饮食，12 h光照周期。所有实验操作均遵守《中国动物实用指南》。

1.2提取白首乌C21甾苷采用95%乙醇回流提取白首乌粗粉，减压回收溶剂得萃取物。萃取物稀释后使用大孔树脂（D101）进行层析，水和95%乙醇洗脱、收集95%乙醇部分洗脱液；选用薄层色谱法进行定性分析；采用紫外-分光光度法测定C21甾体总苷含量。经分析，C21甾苷的可测成分含量达65%左右（按孕甾烯醇酮计）[5]。

1.3实验方法

1.3.1心肌梗死后CHF模型的建立及实验分组给予60只Wistar大鼠腹腔注射1.0%戊巴比妥钠（40 mg/kg），麻醉5～10 min后固定于实验台上，气管插管连接呼吸机行机械通气（呼吸频率每分钟70次，潮气量每次6～7 ml），分离右侧颈动脉，经颈动脉行左心室置管，记录大鼠左心功能变化，选用标准Ⅱ导联连接心电图，并记录波形。经左前胸第3、4肋间开胸，打开心包，挤出大部分心脏，暴露心脏及左心耳[6-7]。于左心耳下方2～3 mm处结扎左冠状动脉前降支，结扎后心电图显示R波振幅明显升高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、avL、avF和V3导联ST段弓背向上抬高＞0.2 mV。1周后复查心电图出现病理性Q波表示心肌梗死模型制作成功，心肌梗死4周后，超声心动图检测显示左心室射血分数（LVEF）≤45%，说明CHF模型成功建立[8]。术后常规抗感染治疗。共成功建立CHF模型34只，随机分为4组：CHF模型组（n=8），给予等体积0.9%氯化钠注射液；白首乌C21甾苷小剂量组（n=8），给予白首乌C21甾苷（0.5 g/kg）；白首乌C21甾苷中剂量组（n=9），给予白首乌C21甾苷（1.0 g/kg）；白首乌C21甾苷大剂量组（n=9），给予白首乌C21甾苷（2.0 g/kg）；另设假手术组（n=10），开胸后在左冠状动脉前降支下方只穿线不结扎，其余方法与模型建立相同，给予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃。各组均为每天1次灌胃，共3周。

1.3.2血流动力学测量用药3周后采用BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）测量大鼠血流动力学参数。大鼠腹腔注射1.0%戊巴比妥钠40 mg/kg，麻醉5～10 min后固定于实验台，分离右颈总动脉1.5 cm，结扎远心端，经颈动脉插入导管至左心室，通过压力感受器与软件相连，5 min后，将导管插入左心室腔。主要参数包括：心率（HR）、左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张期末压（LVEDP）、平均左心室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax）；以Weiss公式计算左心室松弛时间常数（Tau）。

1.3.3心脏指数测量检测血流动力学和超声心动图后，称取大鼠体重（BW），断颈处死，取出心脏。4℃ 0.9%氯化钠注射液冲洗，滤纸吸干。剪去心房和血管组织，称取全心质量（HW），从心室处沿室间隔剪开，称取左心室质量（LVM），计算心脏指数：全心质量指数=HW/BW；左心室质量指数=LVW/BW；左心室心重比=LVW/HW。

1.3.4微血管密度（MVD）测量心室肌组织标本4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、HE染色，显微镜观察。首先选择低倍视野下观察微血管最为丰富处，以管腔内见红细胞为判断标准，然后随机选择3个高倍视野进行拍照。Image-pro Plus 6.0软件系统进行微血管计数，取其平均值。MVD=血管数/mm2。

1.3.5Western blot分析心室肌组织标本在蛋白酶抑制剂存在下匀浆，以获得蛋白提取物，Bradford法测定蛋白质含量。取20 µg蛋白质加入等体积2×上样缓冲液，95 ℃变性5 min。随后进行7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电泳后，电转至0.45 µm硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉PBST（25 mM Tris pH=7.5,150 mM NaCl,0.1% Tween 20）封闭1 h，分别加入抗基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1,SDF-1）抗体（1:2000稀释）4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，每次5 min。加入HRP标记的2抗（1:2000稀释）室温孵育2 h，PBST洗涤3次，每次5 min。按同样的方法与GAPDH抗体孵育。ECL化学发光试剂显色，通过Bio-Rad凝胶成像法检测SDF-1的表达。蛋白的相对表达强度=目标蛋白表达强度三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）蛋白表达强度。

1.3.6Real-Time PCR分析按照TRIzol试剂盒说明书抽提总RNA，采用Nanodrop2000检测RNA纯度。使用M-MLV逆转录试剂盒（Reverse Transcriptase kit promega,Japan）进行逆转录反应成单链cDNA，操作按照试剂盒说明书进行。利用Pubmed查找相关基因序列，并利用引物合成软件Primer Premier 5.0设计引物，引物序列见表1。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物进行扩增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR仪测出ΔC值及熔解曲线，计算出相对基因表达量。每份样品检测3次。

表1　Real-Time PCR序列

1.4统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血流动力学结果与假手术组大鼠比较，CHF模型组大鼠的LVSP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax均明显低于假手术组，LVEDP明显高于假手术组，Tau明显长于假手术组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而CHF模型组和假手术组大鼠的HR差异无统计学意义（P＞0.05）；白首乌C21甾苷中、大剂量组大鼠的LVSP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax明显高于CHF模型组，LVEDP明显低于CHF模型组，Tau明显短于CHF模型组，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2　白首乌C21甾苷对CHF大鼠血流动力学的影响(±s)

表2　白首乌C21甾苷对CHF大鼠血流动力学的影响(±s)

注：与假手术组比较，＊P＜0.05；与CHF模型组比较，＃P＜0.05；与中剂量组比较，$P＜0.05

组别 　例数 HR(次/min) LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg)假手术组 　10 　427±87 　150±41 　2.9±0.7 CHF模型组 　8 　410±85 　121±33＊　9.4±2.1＊小剂量 　8 　424±87 　123±32 　8.9±1.7中剂量 　9 　426±87 　142±36＃　5.7±1.5＃大剂量 　9 　420±86 　148±37＃$　3.6±1.1＃$组别 　例数 +LVdP/dtmax(mmHg/s) -LVdP/dtmax(mmHg/s) 　Tau(ms)假手术组 　10 　4717±868 　-4281±531 　5.6±1.7 CHF模型组 　8 　2913±446＊　-2534±381＊17.3±4.2＊小剂量 　8 　3021±579 　-2775±396 　16.3±4.0中剂量 　9 　4056±717＃　-3876±503＃10.8±3.4＃大剂量 　9 　4172±726＃$　-4035±521＃$　8.2±2.6＃$

2.2心脏指数测量结果CHF模型组大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW均明显高于假手术组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；白首乌C21甾苷中、大剂量组大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW均明显低于CHF模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但白首乌C21甾苷中、大剂量组大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3　白首乌C21甾苷对CHF大鼠心脏指数的影响(±s)

表3　白首乌C21甾苷对CHF大鼠心脏指数的影响(±s)

注：与假手术组比较，＊P＜0.05；与CHF模型组比较，＃P＜0.05

组别 　　例数　HW/BW 　LVW/BW LVW/HW(g/g)假手术组 　10 　0.69±0.19 　0.26±0.071 0.18±0.043 CHF模型组　 8 　0.74±0.20＊0.29±0.078＊0.21±0.058＊小剂量 　 8 0.73±0.20 　0.29±0.072 0.21±0.055中剂量 　 9 　0.71±0.19＃0.27±0.068＃0.18±0.044＃大剂量 　 9 　0.70±0.181＃0.27±0.063＃0.18±0.040＃

2.3MVD测量结果CHF模型组大鼠的MVD明显低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；白首乌C21甾苷中、大剂量组大鼠的MVD明显高于CHF模型组，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4　白首乌C21甾苷对CHF大鼠MVD的影响(±s)

表4　白首乌C21甾苷对CHF大鼠MVD的影响(±s)

注：与假手术组比较，＊P＜0.05；与CHF模型组比较，＃P＜0.05；与中剂量组比较，$P＜0.05

组别 　　例数 　MVD(血管数/mm2)假手术组 　10 　0.170±0.042 CHF模型组 　 8 　0.018±0.005＊小剂量 　 8 　0.027±0.006中剂量 　 9 　0.150±0.037＃大剂量 　 9 　0.170±0.040＃$

2.4Western blot结果CHF模型组大鼠的SDF-1蛋白表达略微升高；白首乌C21甾苷剂量组大鼠的SDF-1蛋白表达均明显高于CHF模型组，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1。

图1　白首乌C21甾苷对CHF大鼠SDF-1蛋白的影响

2.5Real-Time PCR结果CHF模型组大鼠的SDF-1mRNA表达略微升高；白首乌C21甾苷各剂量组大鼠的SDF-1 mRNA表达均明显高于CHF模型组，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

图2　白首乌C21甾苷对CHF大鼠SDF-1 mRNA的影响

3　讨论

CHF是各种心脏疾病的终末阶段，此时心脏功能变化主要表现为心脏收缩功能明显下降，心室舒张功能及心室顺应性发生改变，心脏泵血功能与泵功能储备均降低，血流动力学指标出现异常，进而使心功能降低[9]。本研究结果表明，白首乌C21甾苷可明显升高CHF模型组大鼠LVSP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax，降低LVEDP，缩短Tau，说明其可明显改善CHF大鼠的心功能；心脏指数测量结果表明，白首乌C21甾苷可明显降低CHF模型组大鼠的HW/BW、LVW/BW、LVW/HW，说明其可减轻CHF大鼠心肌肥厚。

同时，本研究还证实白首乌C21甾苷可升高MVD，说明其可增加新生血管形成。为了阐明白首乌C21甾苷促进新生血管形成的可能机制，本研究对SDF-1的表达水平进行了分析。SDF-1最初是从鼠骨髓基质细胞中分离出来的，广泛表达于多种组织、器官、系统，主要表达于心脏、脑、肝和肾脏等[10]。在胚胎发育过程、造血、血管发生、心脏发生、白细胞亚群和内皮细胞的趋化作用中起重要的生理和病理作用。CHF发生后，SDF-1在介导干细胞向心脏迁移和受损心脏的修复过程中发挥重要作用，如将携带SDF-1基因的质粒输送至损伤心肌附近，可诱导CD34+细胞迁移，可明显增强骨髓干细胞向梗死心肌迁移，募集干/祖细胞动员至缺血组织，诱导新生血管形成[11-12]。本研究Western blot结果表明，CHF模型组大鼠较假手术组SDF-1表达水平略升高，其属于机体对不良刺激的一种应激调节反应，当这种应激调节不能够完全对抗外来损伤刺激时，势必造成进一步损伤。给予白首乌C21甾苷干预后，SDF-1表达水平明显升高，且与剂量呈正相关，与CHF模型组比较，差异有统计学意义。进一步采用RT-PCR分析，SDF-1mRNA表达明显升高，结果与Western blot分析结果相似，说明白首乌C21甾苷可升高SDF-1表达水平，诱导CD34+细胞的迁移，从而促进CHF大鼠新生血管形成。

终上所述，白首乌C21甾苷有效改善CHF大鼠心功能。同时可促进新生血管形成，其机制可能与促进SDF-1表达有关。至于白首乌C21甾苷是否通过其他机制发挥防治CHF机制，如对CD34+细胞的影响，需进一步探讨。

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The Protective Effect of Baishouwu C21Steroidal Glycosides on Myocardium in Chronic Heart Failure Rats

Hui Yong

【Abstract】ObjectiveTo investigate the study of C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum on the myocardial protective effect and angiogenesis in chronic heart failure(CHF)rat model and discuss its possible mechanism. MethodsCHF Wistar rats models were established and rats were randomly divided into four groups:CHF model group was administered equal volume of normal saline orally;Low-dose group was administered orally C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum according to 0.5 g/kg;Middle-dose group was administered orally C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum according to 1.0 g/kg;High-dose group was administered orally C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum according to 2.0 g/kg;Another sham group was administered equal volume of normal saline orally.after 3 weeks,Hemodynamics,cardiac index and microvessel density(MVD) were measured. Western blot and Real-Time PCR were used to detect the expression of stromal cell derived factor-1(SDF-1)protein and mRNA.ResultsBaishouwu C21steroidal glycosides and high dose group rats left ventricular systolic pressure (LVSP),mean left ventricular pressure maximum rise and decline rate(±dp/dtmax) was significantly higher than that of the CHF model group,left ventricular diastolic end pressure(LVEDP) was significantly lower than that of the CHF model group,left ventricular relaxation time constant(Tau) was significantly shorter than that of CHF model group,and showed dose dependent,the differences were statistically significant (P＜0.05);Baishouwu C21steroidal glycosides dose group rats SDF-1 protein and mRNA expression were significantly higher than those in the CHF model group, and there was a dose dependent,differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionBaishouwu C21steroidal glycosides effectively improve heart function of CHF rats.At the same time,it can promote the formation of new blood vessels.The mechanism may and promote the expression of SDF-1.

【Key words】C21steroidal glycoside of cynanchum auriculatum;Chronic heart failure;Angiogenesis;Stromal cell derived factor-1

作者简介：惠勇，副主任医师，副教授。研究方向：心血管疾病

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.02.003