猪伪狂犬病病毒强毒株鉴别检测方法研究进展

李 娇，谢金文，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪伪狂犬病病毒强毒株鉴别检测方法研究进展

李 娇1，谢金文2，李 峰2，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

为配合PRV（猪伪狂犬病病毒）gE基因缺失疫苗的推广应用，及时、准确地淘汰PRV强毒感染猪，逐步实现PRV的净化，急需加强PRV强毒株鉴别诊断方法的研究开发与推广应用。文章就近年来针对PRV强毒株各种鉴别诊断方法的最新研究进展进行综述，以期为我国PR（猪伪狂犬病）综合防控措施的制定提供参考依据。

猪伪狂犬病病毒；强毒株；鉴别诊断方法；研究进展

猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的以母猪繁殖障碍、仔猪高病死率和呼吸道疾病为主要特征的一种急性、败血性传染病[1-2]。该病于1902年被首次发现，我国于1947年首次报道。自20世纪90年代以来我国全面推广使用PRV gE基因缺失疫苗，由于该疫苗具有良好的免疫原性，我国有效地控制了该病的发生与流行[3]。但自2011年以来，我国多个省份陆续暴发PR疫情或PRV gE基因缺失疫苗免疫猪场突然野毒抗体转阳，PR在我国发病率和死亡率明显升高[4]，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。PR将是未来几年内危害我国养猪业健康发展的主要疫病之一，故加强PRV强毒株鉴别诊断技术的研究对保障我国养猪业健康发展至关重要。本文就近年来针对PRV强毒株各种鉴别诊断方法的最新研究进展进行综述，以期为我国PR综合防控措施的制定提供参考依据。

1 PCR方法

赵雪丽等[5]根据PRV强毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因，而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性，针对gD/gE基因的5′端核苷酸序列分别设计引物，建立鉴别PRV gE基因缺失疫苗和强毒感染的二重PCR诊断方法，该方法最低检出限为100拷贝/μL，可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因，但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪链球菌（S.suis）、副猪嗜血杆菌（HPS）等病原的检测均为阴性。对835份临床疑似PR感染病料中共检测出PRV gD和gE基因双阳性样品即强毒感染阳性样品267份，随机选取该方法检测出的26份PRV强毒感染样品用于病原分离培养，两种方法的符合率为96.1%。建立的PRV gE基因缺失疫苗和强毒感染的快速鉴别诊断方法灵敏、特异，对于临床上疫苗毒和强毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义。张志等[6]以疫苗株缺失的3.5 kb片段为靶基因，设计了2对PCR引物，建立了能够特异性检测PRV强毒株的套式PCR方法。该方法检测极限可达10拷贝/μL，敏感性是常规PCR方法的1 000倍，并与CSFV、PRRSV、PPV和PCV2等不存在交叉反应。检测150份临床样品，套式PCR方法的阳性率为21.33%，常规PCR方法的阳性率仅为10%。该方法具有特异性高、敏感性强的特点，是一种值得基层推广应用的快速诊断技术，可用于PRV的诊断和流行病学调查等。PCR方法操作简单、检测快速、敏感、特异，套式PCR方法的敏感性更高，适合于基层实验室进行PRV强毒株感染的快速诊断与流行病学调查等。

2 荧光定量PCR方法

实时荧光定量PCR方法是结合常规PCR技术和光谱技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术，与常规PCR方法相比具有敏感性更高、全封闭反应、不需核酸电泳检测、适时定量等优点。吕素芳等[7]根据PRV强毒SA株的gD和gE基因序列设计引物，并对反应条件进行优化，建立了检测PRV gE基因缺失病毒株的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法，其灵敏度比传统PCR方法高100倍，检测PCV2、PPV、CSFV、PRRSV均为阴性，可用于病原学监测、流行病学调查及定量研究。陈如敬等[8]根据PRV gE基因序列设计特异性实时荧光定量引物，建立基于SYBR GreenⅠ染料的PRV实时荧光定量PCR方法，该方法检测PRV gE基因在7.53×10-1～7.53×10-6拷贝/μL范围内有较好的线性关系，检测PCV2、PPV、S.suis、HPS核酸均为阴性，组内和组间变异系数分别为0.31%～1.14%和0.42%～1.74%，该方法敏感性高、特异性强、重复性好，为深入开展PRV强毒感染的诊断以及对宿主致病机制的研究提供了检测手段。余波等[9]根据PRV gE基因序列设计特异性的引物，PCR扩增获得PRV gE基因片段，构建重组质粒pMD18-T-gE作为阳性标准品，对SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化，建立PRV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR诊断方法，组装了诊断试剂盒，该试剂盒在4℃保存1年阳性拷贝数降低100倍，在-20℃保存1年阳性拷贝数检测的偏差在10个拷贝数以内。该试剂盒特异、灵敏、快速、重复性好，适于PRV野毒株临床样品的检测，可应用于PRV野毒株早期感染和潜伏感染检测，有利于PR的净化。荧光定量PCR方法的灵敏度更高，但该方法对仪器设备和操作人员技术水平要求较高，一般基层实验室由于不具备试验条件而无法开展。

3 LAMP方法

张莉等[10]针对PRV gE基因保守区域设计并合成了4条引物，建立了PRV野毒株的LAMP检测方法，并进行了特异性、敏感性和重复性试验，该方法可特异性地检测PRV强毒株，检测PRRSV、PPV、CSFV、猪流感病毒（SIV）、PRV gE基因缺失疫苗株均为阴性。该方法的最低检测量可达100个拷贝质粒DNA，比常规PCR方法的敏感性高10倍。该LAMP方法具有较高的特异性、敏感性和可重复性，可用于伪狂犬病病毒的快速诊断。LAMP方法无需PCR仪等仪器设备，仅需1个恒温水浴锅即可完成整个反应过程，操作简单，检测快速，非常适合于基层兽医实验室和养殖场开展PRV强毒株的鉴别诊断。

4 核酸探针方法

核酸探针技术是近几年迅速发展起来的一种新型分子生物学技术，刘志杰[11]通过PCR方法扩增了304 bp的PRV gE基因片段，将其作为核酸探针来对PRV野毒株进行检测，该探针只与PRV野毒株gE基因同源DNA出现阳性杂交信号，而与PRV gE基因缺失疫苗株、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV的杂交结果均为阴性，该探针最低可检出4 pg的同源DNA，具有很高的特异性和敏感性，可用于PRV野毒株的检测。核酸探针方法根据碱基互补配对原则，特异性更强，敏感性更高，但操作复杂、繁琐，专业人员需要一定的技术水平，一般实验室很难具备试验条件。

5 ELISA（酶联免疫吸附试验）方法

雷有玲等[12]参照已发表的PRV基因组gE基因序列，设计合成1对特异性引物，PCR扩增了长约606 bp的gE基因片段，将目的片段亚克隆至pET30a原核表达载体中，经IPTG诱导重组gE蛋白的表达，重组蛋白纯化后，免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白为包被抗原，经间接ELISA反应条件的优化，建立了检测PRV野毒抗体的间接ELISA方法，该方法检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性，批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%，与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为96.2%。该gE-ELISA检测方法为PRV野毒抗体检测以及野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。吴程华等[13]采用gE-ELISA检测方法对云南省楚雄地区散养户PRV野毒感染情况进行调查，楚雄地区9个散养户154份血清样本中，抗PRV gE抗体的阳性率为25.32%，表明楚雄地区散养户PRV野毒株感染率较高。党占国等[14]采用gE-ELISA检测方法对2012—2015年16个省240个规模化猪场的7 443份血清样品进行PRV野毒抗体的检测，2012年、2013年、2014年、2015年PRV野毒感染抗体阳性率分别为39.4%、39.6%、43.8%、50.8%，表明我国猪场猪伪狂犬病野毒感染呈逐年上升趋势，感染依然严重。ELISA方法操作简单、检测快速、敏感性高、特异性强、稳定性好，非常适用于大批量样品的检测，在基层兽医部门进行大规模流行病学调查中得到了广泛应用，具有良好的应用前景。

6 胶体金免疫层析法

白静等[15]采用PCR方法扩增了600 bp的gE基因片段，将其克隆至pET-22b原核表达载体中，经IPTG诱导重组gE蛋白的表达，蛋白质斑点杂交结果显示重组蛋白具有良好的抗原性。利用金属螯和层析柱对重组蛋白进行纯化后，获得了抗原浓度为1.25 mg/mL的纯化抗原，以柠檬酸钠还原法制备了直径为15～20 nm的胶体金颗粒，将纯化蛋白透析后用胶体金颗粒进行标记，将纯化蛋白透析后喷膜形成抗原线，并以PRV多克隆抗体喷膜形成质控线，组装了检测PRV野毒抗体的胶体金试纸条。该试纸条检测CSFV、PRV gE基因缺失疫苗株、PPV、猪喘气病、猪萎缩性鼻炎等均为阴性，该试纸条与美国IDEXX酶联免疫试剂符合率在98%以上。胶体金免疫层析法具有快速、简便、灵敏、特异性好等特点，无需任何设备20 min内可出检测结果，非常适用于基层实验室和养殖户。

7 小结与展望

为配合PRV gE基因缺失疫苗在我国的推广应用，及时、准确地淘汰PRV野毒感染猪，逐步实现PR的净化，急需加强PRV野毒株鉴别诊断技术的研究开发与推广应用。在PRV的强毒鉴别诊断方法中，常规PCR方法操作简单、检测快速，是目前PRV病原学调查采用的主要方法，但该方法敏感性低于荧光定量PCR、核酸探针、LAMP等方法，容易出现漏检。荧光定量PCR方法弥补了常规PCR方法不能定量的缺点，且其敏感性大幅提高，但该方法对仪器、试剂、操作人员的要求均较高，限制了在基层兽医部门的推广应用。核酸探针和LAMP方法均是新兴的分子生物学检测方法，对仪器、试剂、操作人员的要求较低，但敏感性太高，易导致假阳性结果。ELISA方法操作简单、高通量，是目前PRV野毒抗体检测和血清学调查的主要方法。胶体金免疫层析方法较ELISA方法操作更简单、检测更快速、成本更低廉，但ELISA和胶体金免疫层析方法等血清学方法不能检测到PRV强毒的早期感染和潜伏感染。综合判断，PRV野毒株的各种鉴别诊断方法均具有各自的优缺点，检测人员可根据自身试验条件选择适合的方法。相信随着分子生物学和血清学技术的不断发展，PRV强毒鉴别诊断方法亦会得到不断完善，不断为PR的诊断、流行病学调查、综合防控、净化提供保障。

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[12]雷有玲，张文.猪伪狂犬病毒野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[J].畜牧与兽医，2014，46（11）：60-64.

[13]吴程华，高洪，严玉霖，等.云南省楚雄地区散养户猪伪狂犬病野毒感染的血清学调查[J].黑龙江畜牧兽医，2015（5）：150-151.

[14]党占国，高进勇，孙哲，等.2012—2015年我国部分地区规模化猪场伪狂犬病血清流行病学调查[J].畜牧与兽医，2016，48（8）：76-79.

[15]白静，于新和，边传周.胶体金免疫层析法检测猪PRV gE抗体方法的建立及应用[J].河南科技学院学报，2009，37（1）：30-34.

（编辑：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0090-03

2016-09-07

山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目（SDAIT-06-022-15）

李 娇（1981-），女，满族，辽宁铁岭人，助理研究员，硕士，主要从事动物疫病诊断技术研究.E-mail:lijiao_zone@163.com