我国猪细小病毒病的流行现状及实验室诊断技术研究进展

祖立闯，谢金文，王文秀，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

我国猪细小病毒病的流行现状及实验室诊断技术研究进展

祖立闯1，谢金文2，王文秀2，李 峰2，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪细小病毒病（Porcine parvovirus infection,PPI）是由猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）引起的一种病毒性传染病，能导致母猪以产木乃伊胎、死胎、弱仔和流产、返情、不孕为主要特征的繁殖障碍，特别是对初产母猪的危害最为严重，目前发现一些皮炎、肠炎、呼吸道问题的病例也与PPV的感染有关[1]。我国于1983年首次分离到该病毒，目前呈全国性散发流行。PPV对环境的抵抗力很强，猪场一旦感染后不易净化消除，可能连续几年不断地出现母猪繁殖失败，且PPV常与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等致病原混合感染，使其危害性大幅增加[2]，每年都给养猪业带来一定的经济损失。笔者就目前我国PPI的流行现状及实验室诊断技术进行综述，以期为我国PPI的综合防控提供参考与借鉴。

1 流行现状

赵光伟等[3]利用PCR的方法对川渝地区9个发病猪场的62份病料进行了检测，有3个猪场10份病料为阳性，阳性率为16.1%，表明重庆地区发病猪群中PPV是一个非常重要的致病原。余波等[4]采用ELISA（酶联免疫吸附试验）方法对贵州省未免疫疫苗的176份猪血清进行了抗体检测，阳性率为14.20%，PPV感染在贵州省猪场中普遍存在。杨尚斌等[5]采用ELISA方法对大理地区58个散养户未进行疫苗免疫的243份猪血清进行了检测，阳性率为85.60%，表明大理地区散养户PPI已经普遍流行。范磊等[6]应用ELISA对淮安市清浦区没有免疫疫苗的5个乡镇的规模猪场和散养户共计133份血清样品进行抗体检测，规模猪场和散养户阳性检出率分别是8.99%和9.09%，个别乡镇阳性率高达20%，清浦区大部分乡镇规模猪场和散养户已被PPV污染。李祥峰等[7]采用ELISA方法对楚雄州楚雄市、禄丰县和南华县未免疫猪群的276份样品进行了检测，阳性率为56.9%，表明该地区猪群已被PPV感染。吕忠芬等[8]采用ELISA方法对会泽县未免疫过疫苗的245份猪血清进行了抗体检测，阳性率为66.12%，表明会泽县猪群中PPI已经普遍流行。曾贵英等[9]采用ELISA方法对遵义市14个县27个不同规模猪场未进行疫苗免疫的1 238份猪血清进行了检测，阳性率为10.82%，其中大、中、小型猪场的阳性率分别为5.38%、11.20%、13.68%，表明遵义市不同规模猪场猪群中均存在PPV的感染。彭泽琴等[10]采用ELISA方法对临沧地区未进行疫苗免疫的25份猪血清进行了检测，阳性率为32.0%，表明临沧地区存在PPV的感染。以上流行病学调查资料共同表明，PPI在国内猪群中已流行广泛，且在个别地区感染率较高，感染情况比较严峻，应加强重视。

2 实验室诊断技术

PPV常常与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体等病原混合感染。混合感染加重了疾病的严重程度，同时也增加了PPI临床诊断的难度，故目前对PPV感染的确诊主要依靠实验室诊断技术。目前，PPV常用的实验室诊断技术包括病毒的分离与鉴定、分子生物学和血清学诊断技术。

2.1 病毒的分离与鉴定

病毒分离鉴定方法一直是动物病毒病的经典方法，通过易感接种细胞、观察病变特征等进行诊断，但该方法的试验周期长，操作较繁琐，不适合快速诊断。张婉华等[11]将采集的猪木乃伊胎儿内脏组织处理后接种ST细胞进行病毒分离，ST细胞产生规律性病变，表现为细胞圆缩、拉网、灶性脱落等变化，分离毒适应于ST细胞培养，并可凝集豚鼠红细胞，TCID50随着传代次数升高而逐渐增高，分离毒能被PPV特异性阳性血清中和，而不能被PPV阴性血清中和，分离毒对温度、酸碱不敏感，对乙醚、氯仿等脂溶性溶剂具有较强的抗性，并能抵抗短时间的胰酶处理，接种豚鼠可产生PPV特异性抗体，证实分离毒株为PPV。

2.2 分子生物学诊断技术

2.2.1 PCR方法 PCR方法是根据目的基因设计引物，以病毒基因组DNA为模板，借助DNA聚合酶体外大量扩增目的片段，具有简便、迅速、特异、灵敏等优点，但该方法的敏感性有限，容易漏检。邹敏等[12]参考Gen Bank中发表的PPV VP2基因序列，应用Primer 5.0软件设计1对引物，经PCR反应条件的优化，建立了检测PPV的PCR方法，该方法检测CSFV、PCV2、PRRSV、PRV均为阴性，使用该方法对215份病料进行了检测，检出阳性样品25份，阳性检出率为11.63%，可用于PPI的诊断及流行病学监测。

2.2.2 荧光定量PCR方法 荧光定量PCR技术是融汇PCR技术和光谱技术的一种核酸检测技术，融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，但该方法对仪器设备和技术人员操作水平要求均较高。沈志强等[13]根据GenBank登录的PPV VP2基因序列设计1对特异性引物，经PCR扩增出431 bp的目的片段，产物回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中，提取重组质粒，经PCR及测序鉴定后，作为标准模板建立了检测PPV的SYB GreenⅠ荧光定量PCR方法，该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，R2=0.997 6，产物Tm在82.3～82.9℃之间，检测灵敏度为72.1个拷贝/μL，检测PRRSV、JEV、CSFV、PRV、PCV2均为阴性。实时定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，为PPV的致病机制研究、临床早期诊断及定量分析PPV感染程度提供了准确、敏感的诊断技术，是一种值得推广的快速诊断技术，可用于PPV感染的诊断和流行病学调查。

2.2.3 纳米PCR方法 纳米PCR是一种新型的PCR技术，是在PCR缓冲液加入含有粒径为1～100 nm的纳米金属颗粒，当反应时纳米金属颗粒悬浮在液体里形成纳米流体，这种纳米流体相对于普通流体具有更强的导热性，高导热性能够加快温度升高和下降的速度，使反应体系快速达到目标温度，减少在非目标温度的停留时间，增加特异性反应时间，从而最终达到消除非特异性扩增，提高扩增效率和敏感性的目的。纳米PCR比普通PCR更加敏感，比荧光定量PCR更加方便快捷。崔宇超等[14]针对PPV VP2基因的保守区域设计1对扩增472 bp片段的特异性引物，优化反应条件后建立了PPV纳米PCR检测方法，该方法的最低核酸检出量为4拷贝/μL，敏感性是普通PCR的1 000倍，检测PCV2、PRV、猪捷申病毒（PTV）、PRRSV、CSFV均为阴性，分别采用纳米PCR和普通PCR对3个省份送检的43份临床样品进行了检测，PPV阳性率分别为95%（41/43）和72%（31/43），表明该纳米PCR检测方法具有更高的敏感性，是一种高效的检测手段，适用于PPV低含量临床样品的检测，可以应用于PPV感染的早期诊断。

2.2.4 LAMP方法 环介导等温扩增方法（LAMP）是2000年以后发展起来的一种新型核酸扩增新技术，其依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下扩增核酸，能从仅相差一个核苷酸的基因标本中找出相应靶序列进行扩增，根据扩增与否即可判断目的基因是否存在。LAMP只需在恒温条件下就能完成扩增反应，不需要特殊仪器设备，并且扩增结果可通过反应体系的浊度或加入染料来直观判断，特别适合在现场和基层部门应用，但LAMP方法容易形成气溶胶污染，造成假阳性的结果。陈星瑶等[15]根据PPV VP2基因序列设计LAMP引物，经反应温度、反应时间等反应条件的优化，建立了检测PPV的LAMP方法，该方法在恒温60℃水浴锅中作用45 min即可完成整个反应过程，该方法检测PCV2、PRRSV、PRV、CSFV、猪水疱病病毒（SVDV）、猪流感病毒（SIV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪链球菌均为阴性，该方法的最低检测量为10拷贝/μL。LAMP方法为PPI的诊断提供了一种快速、便捷且特异性强、敏感性高的检测方法，可用于PPI的临床检测，并具有非常良好的应用前景。

2.2.5 液相芯片方法 液相芯片是一种被用于临床诊断的新型生物芯片，该方法先用PCR将靶基因数量放大，再与探针杂交，能大大克服单项PCR中的假阳性和假阴性，保证了结果特异性，是一项突破性的生物芯片分子检测新技术，具有高通量、灵敏度高、重复性好、灵活性大的特点。王晶钰等[16]依据GenBank中PPV结构蛋白VP2基因及PCV2全基因序列，设计PPV和PCV2特异性探针、引物及探针互补序列，将探针与磁性微球偶联，对下游引物和探针互补序列标记生物素，采用不对称性二重PCR扩增靶序列，将PCR产物与偶联好的探针进行杂交，用液相芯片仪进行检测，通过对检测条件优化，建立检测PPV、PCV2两种病毒的二重液相芯片方法，该方法对PPV基因拷贝数检测下限为1.53×104，该方法与PPV单项PCR检测结果符合率为100%，该方法可用于PPV出入境检疫和兽医临床诊断。

2.3 血清学诊断技术

2.3.1 血凝和血凝抑制试验 猪细小病毒具有血凝性，利用病毒的这一特性可以分别建立检测病原的血凝试验（HA）和检测抗体的血凝抑制试验（HI）方法。HA和HI方法操作简便、检测快速、高通量，是基层兽医检测PPV抗原和抗体较为常用的方法，也是PPV最常规、最经典的诊断方法。但HA和HI结果判定的主观性强，难以标准化，而且灵敏度较低、特异性不强，在低滴度感染时难以检出，因此只能作为辅助诊断方法。张婉华等[17]进一步优化了PPV HA、HI微量法试验，比较了不同红细胞悬液浓度、不同液体体积、不同形状微量板对试验的影响，表明豚鼠红细胞悬液浓度由原来的0.25%提高到0.50%，用50 μL体积进行HA试验，用25 μL体积进行HI试验，在“V”型微量板上的试验结果更清晰、更易判断。

2.3.2 间接ELISA方法 间接ELISA方法主要用于检测抗体，首先用特异性抗原包被固相载体，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合，再加入酶标记的第二抗体，使之与待测抗体结合，再加入底物显色，颜色的深浅与标本中待测抗体的量成正比。我国目前统一使用PPV灭活疫苗，灭活疫苗只能诱导机体产生抗结构蛋白抗体，而不能产生抗非结构蛋白抗体，但自然感染的病毒却可以同时产生抗结构蛋白抗体与抗非结构蛋白抗体，故检测NS1非结构蛋白的抗体可对灭活疫苗免疫猪和野毒感染猪进行区分。刘建等[18]分别采用PPV NS1和VP2基因主要抗原区域经原核表达后的NS1和VP2重组蛋白作为包被抗原，分别建立了检测PPV野毒抗体的NS1-ELISA方法和检测免疫抗体的VP2-ELISA方法，2种方法检测PRV、CSFV、PRRSV、PCV2、JEV、FMDV等6种常见猪病病毒的阳性血清均为阴性，检测灵敏度均为1∶12 800，批内、批间重复性试验变异系数均小于10%，NS1-ELISA方法与HI的符合率为100%，VP2-ELISA方法与HI的符合率为94.7%。说明所建立的NS1-ELISA和VP2-ELISA方法均具有良好的重复性、敏感性和特异性，这两种方法的联合运用，可实现PPV野毒感染的快速鉴别诊断和流行病学调查以及猪群免疫疫苗后的抗体水平监测。

2.3.3 双抗夹心ELISA方法 双抗夹心ELISA是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。田莉莉等[19]以原核表达的重组VP2蛋白作为免疫原，免疫6周龄BALB/c雌鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经间接ELISA方法筛选，成功获得了能稳定分泌抗PPV VP2蛋白的单克隆抗体，以多克隆抗体和单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化，建立检测PPV的双抗夹心ELISA方法。该方法检测JEV、PEDV、PRV、PRRSV、CSFV均为阴性，与RT-PCR相比较的符合率、敏感性和特异性分别为93.6%、90.9%、94.4%。双抗夹心ELISA具有良好的重复性、敏感性和特异性，且具有快速、简便、经济、安全、高通量等优点，可应用于PPV感染的早期诊断，为我国PPV感染的诊断、流行病学调查等提供一种简便、快速的高通量检测方法。

2.3.4 IPMA方法 免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）是在感染病毒的多孔细胞培养板中加入待检标本，再加入标有辣根过氧化物酶抗免疫球蛋白特异抗体，经底物显色后利用光学显微镜即可观察结果。刘杉杉等[20]采用病毒感染细胞后固定作为检测抗原，建立了检测PPV血清抗体的IPMA方法，该方法中PPV种毒按照1∶100的剂量接种后48 h固定效果最佳，辣根过氧化物酶-葡萄球菌A蛋白标记物的最适稀释度为1∶1 000，待检血清最适稀释度为1∶100。该IPMA方法与PCV2、PRV、PRRSV和CSFV的参考血清无交叉反应，PPV阳性血清稀释至1∶1 600时仍能检出，该IPMA方法与HI和间接ELISA的符合率分别为96.0%与98.0%，对现地送检的400份猪血清样本进行检测，平均检出阳性率为86.5%。该IPMA方法试验过程所需时间短、操作方便、性能稳定、易于临床推广，并且观察时只需普通的光学显微镜，适用于基层流行病学调查、临床检测和疫苗免疫后血清抗体的监测。

3 小结与展望

现阶段的流行病学调查表明，PPI在我国猪群中呈全国性、散发性、区域性流行，其感染率一直居高不下，感染情况比较严峻，应加强重视。对于PPV的各种实验室检测方法，病毒分离与鉴定试验周期长，不利于快速检测。PCR操作简单，但敏感性有限，且其扩增产物进行电泳使用的溴化乙锭（EB）对环境具有一定的污染。LAMP方法对仪器设备要求较低，但敏感性太高，易产生气溶胶污染。纳米PCR提高了常规PCR方法的敏感性，但仍然没有解决EB对环境的污染问题。荧光定量PCR方法弥补了常规PCR敏感性有限、不能定量以及EB对环境的污染问题，但对仪器、试剂、操作人员技术水平要求均较高，有条件的实验室可选择使用。血清学检测方法在病毒感染的早期无法检测到抗体，具有一定的滞后性，但血清学方法操作简单、检测快速、高通量，可以作为大面积流行病学调查的初筛以及疫苗免疫后的抗体监测。相信随着研究学者对PPV研究的不断深入，以及分子生物学与免疫学技术的进一步完善与标准化，PPI的各种实验室诊断技术必将会走向不断成熟与完善，从而逐步提高我国PPI实验室诊断水平，保障我国PPI防控事业的稳定发展。

参考文献

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（编辑：柳青）

忽思慧：节制饮食 调和喜怒

忽思慧是元代蒙古族著名医学家，兼通蒙、汉医学。他撰写了我国第一部营养学专著《饮膳正要》。他的养生观简介如下。

重视饮食 忽思慧指出，要饥前进食，吃得太饱，容易造成过度饱食，易患肥胖症及其他各种慢性病。要未渴先饮，已渴则体内缺水严重，易造成饮水过多，而饮水过多则使心肾受害。要少食多餐，少餐多食损伤胃肠，又易患肥胖症。

忽思慧认为，早晨一定要吃好早餐；夜晚不可饱食；主张饭后及时漱口。他说：“凡食讫温水漱口，令人无齿疾、口臭。”又说：“清旦盐刷牙，平日无齿疾。”这些论述对于护牙固齿和保持口腔清洁卫生来说，至今仍然很有参考价值。饭后或夜晚漱口刷牙，可及时清除牙缝间的食物残渣，既能保护牙齿，又可防止口臭；漱口水用温水特别是冬天更要用温水而不用冷水，这对防止牙齿松动很有好处；可隔三岔五地用盐水刷牙，对护牙固齿亦有益处。

起居有常 忽思慧说，凡人坐，必要端坐，使正其心；凡人立，必要正立，使直其身。无论做的姿势或站的姿势都要端正，这不但关系到一个人仪表风度，也关系到身心健康。立不可久，久立伤骨；坐不可久，久坐伤肉；行不可久，久行伤筋；卧不可久，久卧伤气；视不可久，久视伤血。无论站、坐、行走、睡卧、视听，均要掌握时间，适可而止，不可过久，过久则容易招致各种损伤。凡日光射，勿凝视，损人目。不可凝望烈日，否则强烈的紫外线会灼伤眼睛。夜晚若亮着灯睡卧，脑垂体就难以正常分泌激素，势必降低睡眠质量，影响人体健康。夜晚就寝以前用温水洗脚，即可温暖四肢，又可使人安眠。

控制情绪 无论喜怒哀乐，均不可太过。忽思慧说，怒不可暴，怒生气疾、恶疮。经常暴怒的人既会损伤正气，又易生痈疽恶疮。常默，元气不伤；少思，慧浊内光；不怒，百神安畅；不恼，心地清凉。乐不可极，欲不可纵。经常少言语而保持清静，就不会损伤元气；不过度思考问题，则头脑清晰，思维敏捷；不愤怒则精神安宁舒畅；不烦恼则心静自然凉。有可喜可乐之事绝不狂喜狂乐，一切嗜欲都必须有所节制，切忌任意放纵。倘能这样做，自然有利于身心健康和延年益寿。

古人自幼重视养生，忽思慧提出，养生保健应从娃娃抓起，不论青少年还是中老年人，都应当高度重视防病健身这一重大问题，绝不可等闲视之。这一观点对现代人养生保健仍有指导作用。

（摘自《中国中医药报》，2016-10-26 王东升/文）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0125-04

2016-10-31

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队建设任务（SDAIT-08-17）；海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室开放课题（HKL201601）

祖立闯（1981-），男，黑龙江宾县人，助理研究员，硕士，主要从事动物疫病诊断技术研究.E-mail:zulichuang2008@126.com