荧光定量PCR技术在猪瘟病毒定量检测中的应用

祖立闯，李 娇，谢金文，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

荧光定量PCR技术在猪瘟病毒定量检测中的应用

祖立闯1，李 娇1，谢金文2，李 峰2，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性、热性和高度接触性传染病[1]，该病流行范围广、致死率高、危害性大，是目前危害我国养猪业的头号杀手[2]。近年来我国猪瘟发病趋势出现了明显的变化，发病率明显降低的同时出现了所谓的非典型猪瘟、温和型猪瘟和无名高热综合征等[3]，使猪瘟野毒感染的临床诊断以及猪瘟强毒株与疫苗毒的鉴别诊断变得非常困难但又十分必要，亟待建立一种可以准确鉴别诊断猪瘟病毒强毒株敏感而特异的检测方法。同时，由于猪瘟病毒不产生细胞病变，《中华人民共和国兽药典》中对猪瘟疫苗的疫苗效力检验采用兔体定型热反应方法[4]，该方法利用试验动物进行检测，成本较高、周期较长、操作繁琐，动物个体差异对试验结果影响较大，亟待建立新型实用、标准化的疫苗效力检验替代方法。荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[5]。通过对PCR过程的实时监控，可专一、灵敏、快速、重复地精确定量起始模板浓度，真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，拥有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点[6]，成为了分子生物学研究的重要工具，为猪瘟的临床诊断以及鉴别诊断、猪瘟疫苗效力检验等提供了技术支持。本文就荧光定量PCR技术在猪瘟病毒基础性研究、猪瘟病毒临床诊断、猪瘟疫苗效力检验、猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别诊断等猪瘟病毒定量检测中的研究与应用进展进行综述，以期为提高我国猪瘟防控水平提供指导依据。

1 荧光定量PCR技术在猪瘟病毒基础性研究中的应用

荧光定量PCR方法的敏感性高，能够准确定量，对分析病毒的组织定位及病毒刺激相关细胞免疫因子的定量检测提供了技术支持。牛金鹏等[7]为分析急性感染期猪瘟病毒的组织定位，及猪瘟病毒感染导致猪急性死亡的致病机理，根据GenBank中发表的猪瘟病毒石门株强毒基因序列，选择5'UTR相对保守区域设计1对引物，经荧光定量PCR反应条件的优化，建立了检测猪瘟病毒的荧光定量RTPCR检测方法，应用该方法对人工感染猪瘟病毒死亡病例的心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结、脑、骨髓、扁桃体、回肠、血清和肠内容物等脏器中的猪瘟病毒进行了定量检测，扁桃体中猪瘟病毒含量最高，脾脏和回肠次之，心、肺、血清中病毒含量也比较高，淋巴结、肝脏、肾、骨髓和脑中病毒含量较低，该SYBR荧光定量PCR方法揭示了猪瘟强毒在急性感染期死亡猪体内的分布情况，为猪瘟致病机理及感染控制的研究奠定了基础。汪志艳等[8]为从细胞免疫水平评价猪瘟病毒弱毒疫苗的免疫效果，针对GenBank中猪IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因设计特异性引物和荧光探针，建立了检测这3种细胞因子Taq Man荧光定量RT-PCR方法，应用3种细胞因子Taq Man荧光定量RT-PCR方法对猪瘟活疫苗进行细胞免疫评价，IFN-γ、IL-2、TNF-α mRNA表达量在猪瘟病毒弱毒疫苗免疫后3～10 d之间均显著升高，而IFN-γ在14 d仍保持高水平表达，表明在猪瘟活疫苗免疫后3 d，猪只已经启动了机体的细胞免疫系统，IFN-γ、IL-2、TNF-α的mRNA表达量均显著上调，机体开始发挥其细胞免疫反应和炎症反应，成功解释了猪瘟疫苗免疫后2～3周才能够监测到中和抗体，但在疫苗免疫后2～4 d，猪只却能够对强毒攻击产生一定抵抗力的原因。

2 荧光定量PCR技术在猪瘟病毒临床诊断中的应用

目前，我国动物疫病感染情况日益复杂，混合感染情况不断增加，仅凭临床症状很难对致病原进行确诊。一般确诊猪瘟病毒主要依据病毒的分离鉴定、RT-PCR、ELISA、胶体金试纸条、荧光抗体试验等，但这些检测方法均有其不足，比如病毒分离鉴定耗时长，ELISA、胶体金试纸条、荧光抗体试验等血清学方法敏感性较低、不能早期检测，普通RT-PCR方法敏感性有限，且不能对病毒进行定量。荧光定量PCR以其快速、高效、特异、灵敏、定量准确等广泛应用到猪瘟病毒的临床诊断中。2012年锦州市周边一存栏200头的猪场，突然暴发以肥育猪厌食、精神不振、体温高热达40℃、可视黏膜和皮肤有针尖大小密集出血点为主要特征的疫病，采集病死猪的组织病料，应用猪瘟实时荧光定量RT-PCR方法检测证实此次疫病由猪瘟病毒感染所致[9]。荧光定量PCR技术特异、敏感，为临床猪瘟病毒感染的诊断和制定科学合理的净化方案提供了技术保障。

3 荧光定量PCR技术在猪瘟疫苗检验中的应用

猪瘟兔化弱毒疫苗在猪瘟防控中起着重要的作用，但猪瘟弱毒疫苗的抗原效价或疫苗效力检验主要采用兔体定型热反应方法，该方法受试验操作、试验动物的个体差异、环境因素及原材料等多方面原因限制了检测结果的准确性与可靠性。鉴于实时荧光定量PCR技术具有敏感性高、特异性强、高通量检测等优点，最主要的是能够对病毒含量进行定量监测，已被广泛地应用于猪瘟疫苗的检验中。范斌等[10]在猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒基因组5'非编码区设计1对标准品引物、1对特异性引物和1条探针，建立了评价猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法，该方法检测的敏感度达1.2×105拷贝/mL，应用该方法对6个不同厂家生产的7种猪瘟兔化弱毒活疫苗的效价进行检测，不同厂家疫苗的效价差异明显，最高可相差3个数量级，建议在选择猪瘟疫苗免疫接种前应该先定量检测疫苗中病毒含量，根据病毒含量进行免疫接种。章秋月等[11]收集福建省内使用的10个不同厂家生产的23个批次猪瘟弱毒疫苗，应用荧光定量RTPCR方法检测疫苗中病毒核酸的含量，抽检23个猪瘟疫苗样品合格率仅为69.56%，其中传代细胞苗的病毒含量相对较高，脾淋苗病毒含量优于细胞苗，不同厂家生产的同类型疫苗病毒含量差异大，同一厂家生产的同类疫苗存在批间差异。实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量是一种便捷、高效的方法，为猪瘟疫苗的检验提供了科学、有效的指导依据。

4 荧光定量PCR技术在猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别诊断中的应用

猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛使用对控制猪瘟的流行起到了关键作用，但由于该疫苗为活疫苗，且没有分子标记，使猪瘟疫苗免疫猪与猪瘟病毒强毒株感染猪难以区分，给猪瘟病毒强毒株的鉴别诊断带来很大困难。传统的病毒分离培养、兔体定型热反应法、动物接种试验、ELISA、免疫荧光试验、胶体金试纸条等检测技术均不能对疫苗株和强毒株进行区分，RT-PCR方法虽可以实现强毒株与疫苗株的鉴别诊断，但常规RT-PCR方法敏感性较低，容易漏检。荧光定量RT-PCR方法的敏感性较常规RTPCR高，且可以实现准确定量，可以作为猪瘟病毒强毒株与疫苗株的鉴别诊断技术在临床中推广应用。杜冬华等[12]为建立猪瘟病毒野毒株和疫苗株快速定量鉴别检测方法，分别根据野毒株和疫苗株E2基因序列差异设计2对特异性引物及1条TaqMan探针，建立了能同时检测猪瘟病毒野毒株和疫苗株的双重TaqMan real-time PCR鉴别检测方法，该双重TaqMan real-time PCR标准曲线Ct值与1×101～1×106拷贝/μL之间的E2基因拷贝数呈良好的线性关系，灵敏度达10拷贝/μL，且特异性和重复性很好。猪瘟病毒野毒株与疫苗株荧光定量鉴别检测方法可用于猪瘟病毒野毒株和疫苗株的鉴别诊断及病原定量分析，将为我国猪瘟病毒野毒株感染及疫苗免疫情况的调查与分析提供高效、快速的检测手段，为更好地防控猪瘟的发生与流行奠定了基础。

5 小结与展望

实时荧光定量PCR方法是结合常规PCR技术和光谱技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术，与常规PCR方法相比具有敏感性更高、特异性更强、定量准确、全封闭反应、自动化检测、不需核酸电泳检测、高通量等优点，成为目前猪瘟病毒检测中最准确的方法。随着分子生物学技术的日趋完善，其在猪瘟病毒的定量检测中将会得到进一步完善和应用，将逐步成为猪瘟疫苗效力检验的替代评价方法、猪瘟病毒临床诊断尤其是猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别诊断的主要方法，以及猪瘟病毒基础性研究必不可少的重要方法。虽然该技术需要价格昂贵的仪器设备、试剂，但随着国家对动物疫病实验室建设资金投入的不断增加，荧光定量PCR技术将逐步成为猪瘟病毒检测中最准确、适合现场应用的方法，不断为我国猪瘟的综合防控事业提供强有力的技术支持。

[1]魏凤，张文通，李峰，等.一起猪瘟的诊治[J].养猪，2016（4）：108-109.

[2]任宝忠.猪瘟防控存在的问题与对策[J].中国畜牧兽医文摘，2016，32（3）：153.

[3]马萍，李达，汤德元，等.鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重RT-PCR检测方法的建立及应用 [J].中国畜牧兽医，2016，43（9）：2230-2239.

[4]王丰，冯志新，还红华，等.自动测温技术用于猪瘟活疫苗兔体热型判定研究[J].中国兽医学报，2015，35（10）：1668-1673.

[5]欧阳松应，杨冬，欧阳红生，等.实时荧光定量PCR技术及其应用[J].生命的化学，2004，24（1）：742-761.

[6]王季秋，赵欣，王照，等.实时荧光定量PCR检测技术及其在病原微生物检测中的应用[J].中国地方病防治杂志，2016，31（5）：517-519.

[7]牛金鹏，韩雪英，郝华芳，等.SYBR荧光定量PCR方法分析猪瘟石门强毒的组织分布[J].中国兽医学报，2013，33（12）：1798-1801.

[8]汪志艳，刘永刚，王刚，等.猪全血中IFN-γ、IL-2、TNF-α Taq Man定量RT-PCR方法的建立及对猪瘟疫苗的免疫评价[J].中国预防兽医学报，2013，35（2）：164-168.

[9]李霞.应用实时荧光定量PCR技术对一例猪瘟的诊断报告[J].中国动物保健，2012，14（10）：61.

[10]范斌，许文花，韩建强，等.猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国畜牧兽医，2014，41（12）：56-61.

[11]章秋月，马华魁，郑新平，等.实时荧光定量RT-PCR法比较猪瘟疫苗病毒含量[J].福建畜牧兽医，2016，38（4）：3-6.

[12]杜冬华，薛拥志，王爱华，等.猪瘟病毒野毒株与疫苗株E2基因双重TaqMan real-time PCR鉴别检测方法的建立[J].中国兽医学报，2015，35（12）：1898-1902.

（编辑：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0119-02

2016-10-13

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队建设任务（SDAIT-08-17）

祖立闯（1981-），男，黑龙江宾县人，助理研究员，硕士，主要从事动物疫病诊断技术研究.E-mail:zulichuang2008@126.com