猪瘟病毒实验室检测方法研究进展

祖立闯,李 娇，谢金文，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪瘟病毒实验室检测方法研究进展

祖立闯1,李 娇1，谢金文2，李 峰2，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，猪瘟的发病率和死亡率都很高，是目前危害我国养猪业的重要病毒性传染病之一[1]。多年来，我国自主研发的猪瘟兔化弱毒疫苗，对猪瘟的防控起到了重要作用。但随着养猪业规模化的快速发展，猪瘟出现新的变异和非典型的临床症状，综合防控难度逐步增加，给猪瘟的实验室诊断提出了更高要求。鉴于此，笔者查阅大量相关资料，对猪瘟病毒的各种实验室检测方法进行综述，以期为猪瘟的临床和实验室诊断提供参考。

1 RT-PCR方法

RT-PCR方法是猪瘟病毒实验室诊断的常用方法，猪瘟病毒属于RNA病毒，须先利用RNA提取试剂提取样品中的病毒基因组RNA，在体外利用反转录酶将病毒基因组RNA合成cDNA，通过目的片段的体外PCR扩增和核酸电泳检测实现病毒核酸的分子生物学检测。检测样品可以是组织病料，也可以是血液样品。陈本龙等[2]根据Genbank上发表的猪瘟病毒全基因组序列和猪瘟病毒强毒株和弱毒株的特异性基因序列各设计1条上游检测引物，同时在保守序列区设计1条强毒株和弱毒株共用的下游引物，建立了一种能够区别猪瘟强毒株和弱毒株的鉴别RTPCR检测方法，强毒株和弱毒株分别扩增出680 bp和785 bp的特异性片段，该方法最低可以检出0.5 pg的猪瘟病毒基因组RNA，有很高的特异性和敏感性，可以用于猪瘟的实验室检测和流行病学调查。

2 RT-nPCR方法

RT-nPCR方法为复合套式RT-PCR反应，是在第1轮RT-PCR反应内部设计引物，以第1轮RTPCR扩增产物为模板进行第2轮PCR扩增反应。吴旭锦等[3]建立了一种基于猪瘟病毒保守的E0基因的RT-nPCR检测方法，该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5ng/L，与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV）无交叉反应，临床检测32份疑似猪瘟病毒感染组织病料，有12份呈现阳性，阳性率为37.5%。建立的RT-nPCR检测方法灵敏度高、特异性强，可作为猪瘟病毒的临床诊断方法，为猪瘟的防控提供参考。

3 荧光定量RT-PCR方法

荧光定量RT-PCR方法是在普通RT-PCR方法的基础上引入荧光染料，通过荧光PCR仪进行RTPCR扩增，比普通的RT-PCR方法更加敏感。余以刚等[4]建立了猪瘟病毒野毒株和疫苗株荧光RT-PCR鉴别方法，该方法对野毒株和疫苗株的检测灵敏度分别达到1 TCID50/mL和0.1 TCID50/mL，组内和组间重复性试验的变异系数在0.7%～2.2%之间，对猪肉、脾脏和血液病料进行猪瘟野毒检测的阳性率分别为66.7%、60.0%、77.8%，而常规RT-PCR方法的阳性率分别为52.4%、40.0%、50.0%，检出率比常规RTPCR方法要高。岳锋等[5]根据猪瘟病毒5'UTR的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了检测猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR方法，该方法最低检测限为1×101拷贝/μL，检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性，组内和组间变异系数均小于2%，具有特异、敏感、重复性好等优点，为猪瘟病毒的临床快速诊断提供了一种敏感、准确和快速的检测方法。

4 RT-LAMP方法

RT-LAMP是环介导等温扩增技术，是一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。通过设计猪瘟病毒特异性检测引物和探针，恒温进行扩增反应，不需要PCR仪等特殊的仪器设备，通过加入荧光染料对扩增结果进行肉眼判读，检测结果直观，适合临床和基层应用。袁向芬等[6]根据猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的保守序列分别设计一套LAMP检测引物，在同一体系中进行RT-LAMP扩增，通过对反应条件优化，建立了可以在63℃恒温下进行猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病毒同步检测的RT-LAMP检测方法，该方法与荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%，可以用于临床两种病原的同步快速检测。朱俊灵等[7]根据猪瘟病毒NS5B基因设计特异性引物及生物素标记探针，结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物，建立了猪瘟病毒的RT-LAMP-LFD检测方法，该方法可以特异检出猪瘟病毒，对RNA的最低检测限为50 pg，反应快速，整个扩增反应可在1 h内完成，操作简单，不需要PCR仪等复杂的仪器，满足基层检疫的需要，是一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。

5 ELISA方法

ELISA方法可以用于猪瘟病毒抗原和抗体的检测，具有敏感、特异、操作简便、快速的特点，其结果具有良好的重复性和稳定性，可以用于实验室样品的批量检测。唐红慧等[8]应用进口猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒对21份猪瘟成品疫苗进行病毒抗原含量测定，与兔体定型热反应相比，两者符合率高达95.8%，表明ELISA方法可以用于猪瘟疫苗的病毒含量测定。蒋卉等[9]采用猪瘟抗体IDEXX ELISA检测试剂盒对注射猪瘟病毒的家兔血清样品进行抗体检测，通过与家兔体温反应做比较，两者有很高的正相关性，符合率为95.83%。ELISA方法可以用于猪瘟疫苗检验的替代方法。吴立君[10]应用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体水平，通过ELSIA方法进行疾病检测在临床上有很好的应用，对猪场的猪病防控起到很好的指导作用。

6 正向间接血凝方法

正向间接血凝方法的原理是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体或抗原作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象。血凝试验是红细胞凝集试验的简称，间接血凝试验是以红细胞作为载体的间接凝集试验，用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验，在临床检验中应用广泛。吕晓娟等[11]应用正向间接血凝试验检测猪瘟免疫抗体，应用该方法对5个规模养殖场和5个散养户的200份血清样品进行检测，规模猪场抗体滴度集中在7 log2～8 log2之间，抗体滴度在5 log2～6 log2和9 log2～10 log2之间的较少，抗体不合格的只有4份，猪瘟抗体的合格率（抗体滴度≥5 log2）为96%，散养户的猪瘟抗体滴度比较分散，抗体滴度在5 log2～6 log2和7 log2～8 log2之间的居多，9 log2～10 log2之间的很少，猪瘟抗体的合格率为85%。正向间接血凝方法操作简单，所需要的仪器设备少，快速、灵敏、特异，适合基层推广应用。

7 小结与展望

猪瘟目前仍是危害我国养猪业的头号杀手，清除和控制猪瘟的发生，需要从多方面提高猪瘟的防控水平，构建准确、实用性高的猪瘟病毒检测方法对实现猪瘟的净化至关重要。本文详细介绍了猪瘟病毒各种检测方法的优缺点以及最新研究进展，其中RT-PCR方法敏感性有限，容易漏检，且不能定量；RT-LAMP方法灵敏度太高，易导致假阳性；荧光定量RT-PCR方法敏感性高、全封闭反应，有效解决了RT-PCR方法容易漏检以及RT-LAMP方法容易污染的问题，且能够实现对病毒含量的定量检测，是目前猪瘟病毒检测中最准确的方法，虽然该方法对仪器、试剂、技术人员水平要求较高，但随着我国基层兽医实验室建设的不断完善，该方法将逐步成为猪瘟病毒临床诊断最适合的方法。正向间接血凝方法和ELISA方法等血清学检测方法不能区分强毒株感染抗体与疫苗免疫抗体，无法实现猪瘟病毒强毒株感染的鉴别诊断，但血清学方法操作简单、高通量，可在猪瘟疫苗免疫后的抗体监测中推广应用。故在临床应用中建议采用血清学方法对猪瘟疫苗免疫效果进行监测，建议采用荧光定量RT-PCR方法对猪瘟病毒感染的疑似病例进行确诊，进而提高猪瘟病毒检测的准确性，准确淘汰强毒感染猪，减少免疫猪被误杀，为猪瘟的净化提供技术保障。

[1]王昶.猪瘟的病因及综合防控措施 [J].中国畜牧兽医文摘，2015，31（11）：134-135.

[2]陈本龙，张立怀，王建华，等.鉴别猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的RT-PCR检测方法的建立[J].中国动物检疫，2013，30（11）：71-74.

[3]吴旭锦，朱小甫.猪瘟病毒RT-nPCR检测方法的建立及陕西部分地区猪瘟病毒E0基因分子特征分析[J].西北农林科技大学学报，2014，42（10）：15-21.

[4]余以刚，黄韵，陶文扬，等.猪瘟病毒野生株和疫苗株荧光RT-PCR鉴别方法的建立 [J].现代食品科技，2013，29（8）：1978-1983.

[5]岳锋，朱艳平，银梅，等.猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国畜牧兽医，2014，41（6）：18-22.

[6]袁向芬，吴绍强，吕继洲，等.猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-LAMP检测方法的建立与应用[J].中国兽医科学，2015，45（7）：721-728.

[7]朱俊灵，叶佐东，邓洁汝，等.猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用[J].华南农业大学学报，2016，37（1）：1-7.

[8]唐红慧，杜希珍，刘大伟，等.应用猪瘟抗原/血清ELISA测定猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量 [J].金陵科技学院学报，2010，26（4）：73-78.

[9]蒋卉，戴志红，王在时，等.猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验替代方法研究Ⅰ家兔效力检验ELISA方法初探 [J].中国兽医杂志，2013，49（5）：9-12.

[10]吴立君.用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体水平的操作步骤及注意事项[J].畜牧兽医科技信息，2015（12）：26-27.

[11]吕晓娟，郭伟，赵佳，等.正向间接血凝试验检测猪瘟免疫抗体的应用[J].畜牧与兽医，2015，47（11）：138.

（编辑：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0117-02

2016-09-22收稿，2016-10-11修回

山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目（SDAIT-06-022-15）

祖立闯（1981-），男，黑龙江宾县人，助理研究员，硕士，主要从事动物疫病诊断技术研究.E-mail:zulichuang2008@126.com