电针穴位对分娩大鼠镇痛效应及5⁃HT mRNA与蛋白表达的影响*

蒋秋燕，王美丽，李 丽，李艳林，王梦莹

（广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023）

电针穴位对分娩大鼠镇痛效应及5⁃HT mRNA与蛋白表达的影响*

蒋秋燕，王美丽，李 丽，李艳林，王梦莹

（广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023）

目的：探讨电针穴位对大鼠分娩的镇痛效应及其中枢5⁃HT、2A受体基因与蛋白的表达。方法：120例孕鼠按随机数字表法分为空白组、电针三阴交穴组、电针合谷穴组、电针合谷加三阴交组、电针血海穴组及药物组。热水甩尾观察镇痛效应，ELISA法检测血清5⁃HT水平，Real⁃timePCR、Westernblot检测中枢5⁃HT及2A受体mRNA与蛋白表达。结果：大鼠痛阈值治疗前（F＝0.736）组间比较差异无统计学意义；治疗后（F＝216.361）组间比较差异有统计学意义；血清5⁃HT、大脑、脊髓5⁃HT及2A受体mRNA与蛋白表达组间比较差异有统计学意义。电针不同穴位由低至高依次为空白组＜血海组＜合谷加三阴交组＜合谷组＜三阴交组＜药物组，不同程度降低血清5⁃HT表达水平，提高大鼠痛阈值及大脑、脊髓5⁃HT及2A受体mRNA与蛋白表达水平。结论：电针不同穴位产生不同针效作用与电针不同程度降低血清5⁃HT表达水平及提高中枢5⁃HT、2A受体mRNA与蛋白表达相关，揭示5⁃HT及2A受体参与电针穴位镇痛的作用机制。

电针穴位；分娩镇痛；5⁃HT及2A受体；mRNA与蛋白表达

分娩镇痛是现代文明的标志，无痛分娩一直是人们追求的目标。针刺具有镇痛作用，而对针刺穴位镇痛机制的研究一直是人们所探讨的问题。5⁃羟色胺（Serotonin，5⁃HT）及2A受体参与疼痛的产生或调制，作为研究疼痛的靶点而受到关注。本研究通过对分娩大鼠应用电针与杜冷丁注射、空白组对照观察其镇痛效应，ELISA检测大鼠血清5⁃HT水平、Real⁃timePCR、Westernblot检测大鼠中枢5⁃HT及2A受体mRNA与蛋白表达，揭示电针穴位对大鼠分娩镇痛效应及作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 造模及分组

3月龄SD健康大鼠，体质量（300±50）g，性成熟未交配及普通清洁鼠饲料均由广西医科大学实验动物中心提供。大鼠按雌、雄1∶1比例合笼，自由摄食、饮水。每日上午检查托盘，发现阴栓则将雌鼠取出编号观察，腹部膨隆确定为妊娠。对120例造模成功的孕鼠按随机数字数字表法［1］分为空白组、电针组（三阴交穴组、合谷穴组、血海穴组、合谷加三阴交穴组）及药物组各20例。

1.2 治疗方法

孕鼠在妊娠第19天开始灌服蓖麻油启动产程。空白组未行任何干预措施自然分娩，电针组在大鼠产程启动开始电针。取穴［2］：电针合谷组在两前肢第一二掌骨之间取穴直刺1 mm，旁开1 mm同一穴再针入1针。电针血海组在两后肢股内侧中间，髌底内侧端至耻骨联合连线的下1／9处取穴直刺5 mm，旁开1 mm2一穴再针入1针。电针三阴交组在两后肢内踝尖直上10 mm处直刺3 mm，旁开1 mm同一穴再针入1针。电针合谷加三阴交组方法同上。避免两针相触短路，胶布固定后与电针仪连接，同一对正负极连接同一穴，能引起大鼠肢体轻微抖动为针刺得气，频率为2 Hz和100 Hz交替的疏密波，电压9 V，强度0.1～0.3 mA，波宽0.2～0.6 mS，每次20 min，每隔2 h电针1次，直至产下最后1个仔鼠止；药物组在孕鼠产程启动后皮下注射杜冷1次，用量按体表面积等效剂量换算比率计算，即按人常用量100 mg／d，大鼠剂量100 mg×0.018＝1.8 mg，200 g体质量大鼠的剂量为1.8 mg×0.2＝9 mg／kg）。200 g大鼠皮下注射杜冷丁1.8 mg，250 g大鼠皮下注射杜冷丁2.25 mg［3］。

1.3 大鼠痛阈测定方法

热水甩尾痛阈测定，各组大鼠在治疗前后分别以（50±0.5℃）热水浸烫鼠尾2cm，记录入水至甩尾出水的间隔时间（测量3次取其均数，时间按秒计算）。因大鼠针刺后最高痛阈值并不都在同一时段出现，针刺前后10 min、20 min、30 min、60 min共5个测量时段，而统计分析时则不分时段选取最大痛阈值，观察大鼠鼠尾热水浸烫至甩尾出水的间隔时间。统计学分析，痛阈值以s计量，所有测量数据以均数±标准差（±s）表示，采用STATA8.0软件进行统计分析，针刺前后痛阈值比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析［4］。

1.4 标本采集方法

各组大鼠在接受以上治疗方法产下最后1个鼠仔时断头取血6 ml左右，30 min内完成离心，将血清放置无热原、无内毒素试管，标号冻存于－20～－70℃电冰箱，以备ELISA检测；迅速用生理盐水洗干净，选择大脑灰质顶叶区及脊髓腰膨大段，标号保存在－80℃冰箱备Real⁃time PCR。所有标本均在3个月内完成检测。

1.5 仪器、试剂及步骤

1.5.1 实验仪器 PCR反应扩增仪（美国ABI公司Applied Biosystems 2720 Thermal cycler）；DYY⁃8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；YXJ⁃2离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；H6⁃1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；凝胶成像系统（Gene Genius公司）；TU⁃1901紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；StepOne型荧光定量PCR仪（ABI）。

1.5.2 实验试剂 大鼠5⁃HT、ELISA Kit（货号FA01983B）由上海科兴商贸有限公司进口美国TSZ公司产品。

Real⁃time PCR引物由生工生物工程上海（股份）有限公司设计与合成，LightCyclerR480 DNA SYBR Green I Master由生工生物工程上海（股份）有限公司提供。TRIzol试剂购于invitrogen公司，定量PCR试剂：ABI SybrGreen PCR Master Mix（2X）购于ABI公司DNA Marker，第一链cDNA合成试剂盒（AMV First Strand cDNA Synthesis Kit），氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC H2O，6×DNA Loading Dye，10 ×TAE（400mM Tris⁃acetateand 10mM EDTA，pH8.0）等其他试剂均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5.3 实验步骤 血清5⁃HT水平分析采用ELISA检测分析，具体操作按说明书进行；Real⁃time PCR检测分析5⁃HT及2A受体mRNA表达，分别将大鼠脑灰质顶叶区及脊髓腰膨大段提取总RNA，将RNA逆转录为 cDNA，－20℃保存备用。5⁃HT引物：F：5′GTCACCT GCGACCTGTTTATC 3′，R：5′GCGTCCTTTTGTTCAC ATAGTCT 3′，5⁃HT2A引物，F：5′TGCCACCAACT ATTTCCTGAT3′，R：5′AAGAGCACATCCAGGTAAA，TCC 3′；管家基因（β⁃actin）引物，F：5′⁃CGTAAAGACCTCTATGCC AAC A⁃3′，R：5′⁃CGG ACTCA CGTACTCCTGCT⁃3′。扩增条件：95℃ 2 min，95℃ 10 s变性，60℃40 s退火，72℃延伸，40个循环。Trizol Reagent由invitrogen提供。Western blot检测中枢5⁃HT及2A受体蛋白表达，将大鼠大脑灰质、脊髓腰椎膨大段组织总蛋白提取，称取120 mg加入预冷500 uL细胞裂解液，裂解30 min离心4℃，12000 r／min 20 min，蛋白定量。将蛋白上样缓冲液稀释，煮4 min置 －80℃ 备用。经SDS⁃PAGE电泳分离，至溴酚蓝刚跑出分离胶时停止电泳。然后转膜（250 mA，90 min），取下PVDF膜用5%脱脂奶粉进行封闭，在室温下振摇1～2 h，滴加一抗在封闭的膜内，4℃过夜。次日PBS漂洗15 min×1次，将膜用TBST清洗4次，每次5 min，再与二抗室温下孵育1 h。TBST清洗后，将显影剂滴加到PVDF膜正面，凝胶图像系统分析目标蛋白灰度值。BCA蛋白浓度测定试剂盒由Biovision公司提供，抗5⁃HT、5HT2A抗体由abcam公司提供，二抗及化学发光试剂盒由Abbkine公司提供。按说明书进行操作。

1.6 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，各组间均数两两比较采用LSD检验，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组大鼠痛阈值及血清5⁃HT表达比较

表1显示，6组大鼠痛阈值干预前比较差异无统计学意义（P＞0.05），干预后比较差异有统计学意义（P＜0.01）。配对t检验结果显示，除空白组外，其他各组均显著高于干预前。进一步LSD多重比较结果显示，与空白组比较，电针各穴位组及药物组痛阈明显升高，痛阈由低至高依次为空白对照组＜血海组＜合谷加三阴交组＜合谷组＜三阴交组＜药物组；血清5⁃HT含量方差分析结果显示，组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）。除空白对照组外，其他5组大鼠血清5⁃HT表达水平均有不同程度降低，降低作用由低至高依次为空白对照组＜血海组＜合谷加三阴交组＜合谷组＜三阴交组＜药物组。

表1 6组大鼠痛阈值及血清5⁃HT比较（±s）

表1 6组大鼠痛阈值及血清5⁃HT比较（±s）

注：与空白组比较：∗∗P＜0.01；与三阴交组比较：§§P＜0.01；与血海组比较：＃＃P＜0.01

组别 例数 干预前痛阈 干预后痛阈 5⁃HT（Pg／ml）空 白 对 照 组 20 6.94±0.89 7.26±1.09 204.08±8.69电 针 三 阴 交 穴 20 6.98±1.06 18.26±1.21∗∗ 119.45±18.19∗∗电 针 合 谷 穴 20 6.86±1.00 15.96±1.52 151.76±14.49电针合谷加三阴交 20 7.31±0.82 14.28±0.97 134.35±7.17电 针 血 海 穴 20 6.77±1.04 12.14±1.30∗∗§§ 187.80±20.10∗∗§§药 物 组 20 7.01±0.96 19.45±1.84∗∗§§＃＃ 98.12±22.61∗∗§§＃＃F 0.736 216.361 124.647 P P＝0.598＞0.05 P＝0.000＜0.01 P＜0.01

2.2 6组大鼠中枢5⁃HT、5⁃HT 2A受体mRNA表达

表2显示，Real⁃time PCR检测6组大鼠中枢5⁃HT、2A受体及β⁃actin扩增曲线拐点清晰，指数值明显，基线平无上扬，扩增到平台期，各管扩增效率接近，扩增效率高，提示PCR扩增良好；由熔解曲线可见，熔解曲线呈单一峰，说明所有基因扩增的特异性，无非特异性产物存在。6组大鼠中枢5⁃HT、2A受体 mRNA表达比较差异有统计学意义（P＜0.01）。LSD多重比较显示，由低至高依次为空白组＜血海组＜合谷组＜合谷加三阴交组＜三阴交组＜药物组。

表2 6组大鼠中枢5⁃HT、5⁃HT 2A受体mRNA表达水平比值（±s）

表2 6组大鼠中枢5⁃HT、5⁃HT 2A受体mRNA表达水平比值（±s）

注：与空白组比较：∗∗P＜0.01；与三阴交组比较：§§P＜0.01；与血海组比较：＃＃P＜0.01

组别 例数 大脑灰质脊髓膨大段腰5⁃HT 5⁃HT 2A受体 5⁃HT 5⁃HT 2A受体空 白 对 照 组 20 1 1 1 1电 针 三 阴 交 穴 20 2.0278±0.4904∗∗ 1.7573±0.2166∗∗ 1.5954±0.1407∗∗ 1.4050±0.3472∗∗电 针 合 谷 穴 20 1.6500±0.4331 1.3939±0.1318 1.3916±0.0225 1.1186±0.336电针合谷加三阴交 20 1.6651±0.4185 1.5129±0.1477 1.4905±0.1369 1.2136±0.3715电 针 血 海 穴 20 1.4127±0.4304∗∗§§ 1.2401±0.1224∗∗§§ 1.2907±0.1618∗∗§§ 1.0645±0.5737∗∗§§药 物 组 20 2.1782±0.3540∗∗§§＃＃ 2.0939±0.3158∗∗§§＃＃ 1.7024±0.0983∗∗§§＃＃ 1.3106±0.3031∗∗§§＃＃F 23.653 89.404 99.059 3.585 P 0.000 0.000 0.000 0.005

2.3 6组大鼠中枢5⁃HT、5⁃HT 2A受体蛋白表达

表3图1显示，Western Blot检测6组大鼠中枢5⁃HT、5⁃HT 2A受体蛋白表达水平，并与内参β⁃actin相比较，蛋白单条条带清晰，片段大小与目的蛋白相符，6组蛋白条带灰度扫描与β⁃actin蛋白条带灰度比值为5⁃HT、5⁃HT 2A受体蛋白表达水平。方差分析结果显示，大脑灰质5⁃HT（P＜0.01），5⁃HT 2A受体（P＜0.01），脊髓5⁃HT（P＜0.01），5⁃HT 2A受体（P＜0.01）。大脑、脊髓5⁃HT、5⁃HT 2A受体蛋白表达水平在6组大鼠之间分布差异明显，有统计学意义（P＜0.001）。进一步LSD多重比较显示，与空白对照组比较，电针各穴位组、药物组均明显升高，各组升高作用由低至高依次为空白组＜血海组＜合谷组＜合谷加三阴交组＜三阴交组＜药物组。

3 讨论

杜冷丁注射是目前临床常用的分娩镇痛药物，但其有可能通过胎盘进入胎儿体内对新生儿产生一过性的不良影响。中医学认为，分娩疼痛的产生是由于产时胎头压迫产道使气血运行障碍，“不通则痛、不荣亦痛”。针刺有通经脉、调血气“通则不痛”的镇痛机制。三阴交属于足太阴脾经、足厥阴肝经、足少阴肾经的交会穴，针刺其穴可以同时激发肝、脾、肾、任脉等多条经脉的经气，从而“气至病所”，起到缓解分娩疼痛的作用。合谷穴为手阳明经原穴，阳明为多气多血之经，能行气活血、振奋周身之阳气；三阴交加合谷穴为远隔配穴，远近相承，阴阳互济，可理气行血。《针灸大成》有“合谷补即坠胎”，它是传统的下胎方；血海穴为足太阴脾经要穴之一，因善治血证而得此名，有疏肝、调气血、调经的作用。本研究结果发现，电针不同穴位可不同程度地提高分娩大鼠痛阈值，由低至高依次为血海组＜合谷加三阴交组＜合谷组＜三阴交组，由此说明经络腧穴间具有不同针效作用。

表3 6组大鼠中枢5⁃HT、5⁃HT 2A受体蛋白灰度值比较（±s）

表3 6组大鼠中枢5⁃HT、5⁃HT 2A受体蛋白灰度值比较（±s）

注：与空白组比较：∗∗P＜0.01；与三阴交组比较：§§P＜0.01；与血海组比较：＃＃P＜0.01

组别 例数 大脑灰质脊髓膨大段腰5⁃HT 5⁃HT 2A受体 5⁃HT 5⁃HT 2A受体空 白 对 照 组 20 0.2245±0.0011 0.4540±0.0167 0.2070±0.0035 0.0918±0.0305电 针 三 阴 交 穴 20 0.2695±0.0032∗∗ 1.9464±0.0256∗∗ 0.2930±0.0005∗∗ 1.7513±0.0141∗∗电 针 合 谷 穴 20 0.2268±0.0024 1.4200±0.0086 0.1755±0.0012 1.1510±0.0033电针合谷加三阴交 20 0.2340±0.0003 1.6700±0.0300 0.1780±0.0004 1.4900±0.0093电 针 血 海 穴 20 0.2250±0.0015∗∗§§ 0.7800±0.0974∗∗§§ 0.1740±0.0004∗∗§§ 0.8000±0.0370∗∗§§药 物 组 20 0.2745±0.0002∗∗§§＃＃ 1.9750±0.0302∗∗§§＃＃ 0.3023±0.0035∗∗§§＃＃ 1.7800±0.0140∗∗§§＃＃F 3273.675 3860.178 17509.260 18148.677 P 0.000 00.000 0.000 0.000

图1 6组大鼠大脑、脊髓5⁃HT、5⁃HT 2A受体蛋白表达

其次，从神经解剖学显示，支配子宫的交感神经来自T10⁃S2节段［5］，副交感神经来自L6⁃S1神经节段［6⁃7］，即支配大鼠子宫的神经纤维来自T10⁃S2，峰值在T13⁃L2和L6⁃S10。而支配大鼠三阴交穴神经纤维来自L3⁃6，合谷穴相应的神经节段主要分布在C5⁃T1范围内，血海穴神经纤维来自L3⁃4［8］。因此，出现电针不同穴位针效作用差异性是与该穴位经络腧穴功能及其所处位置的神经节段支配有关。

随着针刺作用机制研究的不断深入，5⁃HT系统作为研究疼痛的靶点越来越受到人们的关注。5⁃HT是一种单胺类神经递质，分布在外周和中枢神经系统中，研究证实5⁃HT2A受体参与疼痛产生或调制［9］。陈瑾等［10］发现，中枢及外周5⁃HT及2A受体不但参与针刺镇痛的即时效应，而且参与了较为显著的后效应。

本研究结果显示，电针不同穴位可产生不同的镇痛作用，由低至高依次为血海组＜合谷加三阴交组＜合谷组＜三阴交组，不同程度降低血清5⁃HT表达水平，提高了中枢5⁃HT、2A受体mRNA与蛋白表达。提示各穴位在痛阈值、外周及中枢5⁃HT表达，穴位间变化趋势一致；而不同穴位针效作用以三阴交组较好，血海相对较差。穴位间出现的这种差异性，推测可能与该穴位所在的经络腧穴功效及其所处的神经解剖学位置有关，由此揭示5⁃HT及2A受体参与电针穴位镇痛的作用机制。本研究成果可为分娩镇痛提供一种有效、操作简单、对母婴安全、无损伤的治疗方法，为电针分娩镇痛的进一步研究提供了科学依据和理论基础。

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Effects of Electric Acupuncture Acupoints for Childbirth Analgesia Rats and 5⁃HT mRNA and Protein Expression

JIANG Qiu⁃yan，WANG Mei⁃li，LI Li，LI Yan⁃ling，WANG Meng⁃ying
（First affiliated hospital of Guangxi TCM University，Nanning 530023，China）

Objective：To explore the analgesic effect of electric acupuncture on labor of pregnant rat，mRNA and protein of central 5⁃HT and receptor，Method：120 successful models of pregnant rats into control group，model group，Sanyinjiao group，Hegu group，Hegu plus Sanyinjiao group，Xuehai group，Meperidine group.observing the analgesic effect through hot flick method of measurement of pain.Detecting the serum 5⁃HT level by ELISA method，detect expression of the rat central 5⁃HT and receptor mRNA and Western blot by Real⁃time PCR.Results：Before treatment，the differences of pain threshold among the groups are not statistically significant（F＝0.736）；After treatment（F＝216.361），there were statistically significant differences between groups.Serum 5⁃HT，cerebral spinal 5⁃HT mRNA and protein 2A receptor，and，significant differences between the groups was statistically significant.Electrical Acupuncture from low to high were model group＜Xuehai group＜Hegu plus＋Sanyinjiao group＜Hegu group＜Sanyinjiao group＜Meperidine group.Varying degrees of reduction of serum expression levels of 5⁃HT.Improving and increasing the pain threshold of rat brain，spinal cord and the 5⁃HT 2A receptor mRNA and protein expression levels.Conclusion：Electrical Acupuncture needles have different effects and EA effect to vary degrees to reduce serum levels of 5⁃HT expression and improve the central 5⁃HT，2A receptor mRNA and protein expression associated reveals 5⁃HT 2A receptor is involved and EA acupuncture analgesia mechanism.

Electric acupuncture；Labor analgesia；5⁃HT 2A receptor；mRNA and protein expression

R245.9＋7

：B

：1006⁃3250（2016）10⁃1376⁃04

2016⁃03⁃10

2012年国家自然科学基金资助项目（81260547）⁃不同穴位电针对分娩疼痛相关神经递质mRNA及蛋白表达影响的研究

蒋秋燕，女，教授，主任医师，硕士研究生导师，从事针灸无痛分娩的临床与研究。