一种生物X射线小角散射光束线站自动换样溶液蠕动装置

洪春霞　　周　平　　李怡雯，2　　曾建荣　　边风刚　　王　劼（中国科学院上海应用物理研究所　张江园区　　上海　20204）2（中国科学院大学　　北京　00049）



一种生物X射线小角散射光束线站自动换样溶液蠕动装置

洪春霞1周平1李怡雯1，2曾建荣1边风刚1王劼1
1（中国科学院上海应用物理研究所张江园区上海201204）2（中国科学院大学北京100049）

摘要利用同步辐射X射线小角散射技术可以研究溶液中蛋白质的结构信息。但是在实验过程中，高通量的X射线易造成蛋白质的辐射损伤，发生结构变化。本文介绍了一种自动换样溶液样品蠕动装置，在实验过程中利用Hamilton的PSD/4注射泵控制样品上下运动，减小单位体积照射时间以降低X射线对蛋白质的辐射损伤。此外，通过对注射泵、准直调节台和样品/缓冲液支撑台的协调控制实现了自动换样、回样和清洗功能，提高了实验效率。在上海光源生物X射线小角散射实验站进行了实验，通过对静止模式和蠕动模式下溶菌酶的散射曲线及回旋半径的测量，表明该装置可达到很好的防辐射损伤效果，实现了预期的样品蠕动装置功能。关键词实验物理及工业控制系统，生物X射线小角散射，控制系统工具箱，辐射损伤

国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（No.2011CB911104）、国家自然科学基金（No.11305242）资助

第一作者：洪春霞，女，1984年出生，2009年于南京航空航天大学获硕士学位，研究方向为小角散射实验站控制系统

SupportedbyNationalKeyBasicResearchDevelopmentProgram（973Program）（No.2011CB911104），NationalNaturalScienceFoundationofChina （No.11305242）

Firstauthor:HONGChunxia，female，bornin1984，graduatedfromNanjingUniversityofAeronautics＆Astronauticswithamaster’sdegreein2009，focusingonsmallanglescatteringexperimentalstationcontrolsystem

An automatic solution-sample-changing peristaltic device at biological small angle X-ray scattering beamline

HONGChunxia1ZHOUPing1LIYiwen1，2ZENGJianrong1BIANFenggang1WANGJie1
1（Shanghai Institute of Applied Physics， Chinese Academy of Sciences， Zhangjiang Campus， Shanghai 201204， China）2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049，China）

Abstract Background:Proteinstructureinsolutioncanbestudiedbysmall-angleX-rayscatteringtechniquesat synchrotronradiationfacilities.However，thestructureofproteinispronetovaryastheradiationdamageinducedby theintenseX-raybeamduringtheexperiments.Purpose:Thisstudyaimstodevelopanautomaticsolution-samplechangingperistalticdeviceforbiologicalsmallangleX-rayscatteringexperiment.Methods:Theinjectionpump PSD/4ofHamiltonisappliedtoeliminatetheradiationdamageofproteinbyminimizingtheX-rayirradiationtimeof unitvolume.Inaddition，automaticsample-changing，retrievingandcleaningwasrealizedbythecoordinatedcontrol ofPSD/4，thealignmentcontrolstageandthesample/buffercontrolstage.Thustheexperimentefficiencyis improved.Results:Thescatteringcurvesandgyrationradiusoflysozymeunderstationarycollectionmodeand peristalticcollectionmodeweremeasuredbyexperimentscarriedoutatbiologicalsmallangleX-rayscattering beamlineofShanghaiSynchrotronRadiationFacility（SSRF）.Andresultsshowthatthisdevicecanpreventradiation damageofsampleefficiently.Conclusion:Thedesignedfunctionalitieshavebeenachievedasexpected.

Key words EPICS（ExperimentalPhysicsandIndustrialControlSystem），BioSAXS，CSS（ControlSystemStudio），Radiationdamage

上海同步辐射光源（ShanghaiSynchrotron RadiationFacility，SSRF）是第三代同步辐射装置，是目前世界上已建造或正在建造中的第三代同步辐射光源中最先进的装置之一。生物X射线小角散射光束线站（BiologicalSmallAngleX-RayScattering，BioSAXS线站，代号BL19U2）是国家蛋白质科学研究上海设施五线六站之一，BioSAXS实验站以蛋白质在自然状态下的结构、动态变化和相互作用为主要研究方向。蛋白质处于液体状态时，更接近于生理条件下蛋白质的状态[1]。在BioSAXS测量中，蛋白质若受到辐射损伤，容易发生变性和结构变化。为避免同步辐射测量过程中对蛋白质的伤害，需要使用溶液样品蠕动装置，而控制系统是该装置的关键部分，用于调节样品的照射位置与照射时间以降低辐射伤害。

目前国际上虽有商品化的实验室溶液进样设备，但鉴于国内外同步辐射实验站的布局和具体要求，需要进行软硬件改造才可以与实验站其它设备集成为一体。例如由欧洲分子生物学实验室（EuropeanMolecularBiologyLaboratory，EMBL）-Hamburg、EMBL-Grenoble和欧洲同步辐射光源（EuropeanSynchrotronRadiationFacility，ESRF）共同研发的BioSAXS自动换样器，主要用于生物小角散射实验，它使用样品的体积为10－40μL，样品浓度为0.5－10mg·mL-1，已经安装在ESRFBM29光束线、EMBLP12光束线和英国“钻石”同步辐射光源I22/B21光束线，后来Bruker公司把它研制成商品化设备[2－3]。

美国斯坦福同步辐射光源（StanfordSynchrotron RadiationLightsource，SSRL）生物小角X射线散射/衍射实验站（BL4-2）的自动进样器，用于生物溶液样品散射实验，例如蛋白质、DNA、RNA、油脂及其复合物，使用样品体积为10－30μL，控制软件使用BluIce编写，可以完全集成于实验站BluIce控制系统[4]。而国内尚未有相应的实验室设备，因此需要自行研制适用于上海光源BioSAXS实验站的溶液进样设备。主题名称为一种溶液样品蠕动实验系统（实用新型专利号：ZL201410038379；发明专利申请号：201410038379.5）的专利实现了一种溶液蠕动实验系统[5]，但是该装置主要用在SSRF的小角散射光束线站（BL16B1），并且每次只能做一个样品，由于BL16B1与BL19U2实验站硬件平台和软件平台都不相同，因而本研究在该专利的基础上进行了升级改造，包括硬件和软件改造，本文研究的溶液装置使用样品体积小（30μL），注射泵抽取样品体积的精度为3%，一次可以做多个样品实验，并且可以自动开启实验站快门和探测器进行数据采集，操作更加自动化，进一步提高了实验效率。

1　溶液样品蠕动装置介绍

蛋白质溶液在进行X射线小角散射研究时易发生辐射损伤，使用蠕动方式可有效地抑制辐射损伤，即样品在检测位置上下运动。本装置采用Hamilton 的PSD/4注射泵控制样品的运动，通过对注射泵、准直调节台和样品/缓冲液支撑台的协调控制实现对样品的定位、清洗、干燥、取样、样品蠕动、速度设定、回样等功能。

1.1溶液样品蠕动装置硬件结构

样品蠕动装置硬件包括控温装置、石英毛细管样品室、上/下导管、样品暂存室、两个二维调节台、清洗液容器、废液容器和八孔阀注射泵。二维调节台由控制电脑通过基于VME总线的控制机箱和电机驱动器进行控制，可以达到较高的位置精度[6]。

为降低背景散射，使用的石英毛细管样品室的壁厚为10μm，直径为1mm，它安装在铜制的循环水控温装置内，控温装置安装在二维光路准直调节台上。为提高实验的自动化、实验效率和机时利用率，专门设计可以同时放置两种缓冲液和6种样品的样品暂存室，样品暂存室放置在另一个控温装置内，同时在此温控装置上设计一个用于连接外部废液容器的小孔，该控温装置安装在二维样品/缓冲液调节台上，和注射泵配合实现自动换样。

X射线照射到蛋白质溶液样品上，散射后的强度被Pilatus1M探测器记录，可以得到SAXS的原始数据，待数据处理后可得到蛋白质的结构信息。该装置硬件实物图及在光路中的位置如图1所示。溶液样品蠕动装置结构图如图2所示。

图1　装置硬件示意图Fig.1　Schematics　of　hardware　installation.

图2　溶液样品蠕动装置结构图Fig.2　Schemetic　diagram　of　the　solution　peristaltic　device.

1.2控制软件开发平台EPICS和CSS简介

实验物理及工业控制系统（Experimental PhysicsandIndustrialControlSystem，EPICS）是由美国洛斯阿拉莫斯国家实验室（LosAlamosNational Laboratory，LANL）和阿贡国家实验室（Argonne NationalLaboratory，ANL）等联合研制开发的实验物理和工业控制系统软件包[7]。EPICS提供丰富的控制系统软件开发工具，可以用来建立分布式的控制系统体系结构。上海光源整体控制系统使用EPICS控制软件[8]，为与上海光源整体控制系统进行集成，该装置的控制部分也采用EPICS控制系统软件包实现。

控制系统工具箱（ControlSystemStudio，CSS）主要是由美国橡树岭国家实验室散裂中子源（SpallationNeutronSource，SNS）、美国布鲁克海文国家实验室（BrookhavenNationalLaboratory，BNL）和德国电子同步加速器研究所（Deutsches ElektronenSynchrotron，DESY）合作开发而成，采用了EclipseRCP（RichClientPlatform）的框架结构[9]，是一个集成多个应用程序插件的开发工具软件，用于监控和操作大型控制系统，在本研究中用于控制软件的界面制作。

SSRF首批7条光束线和国家蛋白质研究设施五线六站的控制硬件均采用标准化的基于VME总线的MAXv控制器，软件在EPICS平台下开发完成[10]。

2　溶液样品蠕动装置系统设计与实现

2.1硬件设计

溶液样品蠕动装置实现了溶液样品自动进样、自动换样、自动清洗、样品蠕动等功能，满足了同步辐射实验站溶液样品自动化操作的需求。

注射泵上安装八孔阀，在本装置中，使用了标号是1、3、6、8的4个阀孔，分别连接石英毛细管样品室的上导管、装有酒精的容器、超纯水容器和空气，后三种用于溶液冲洗。两个二维调节台均包括水平位置调节和垂直位置调节，分别用于石英毛细管样品室的光路准直和样品暂存室的调节。

本装置控制过程为：

1）调节光路准直调节台的垂直和水平位置，使样品室中心对准实验站的光束。

2）调节样品/缓冲液电动台位置，使废液池孔（直径最小的孔）的中心对准样品蠕动装置的下导管处。

3）标定其余样品缓存室不同孔的水平和垂直位置，以便进行多个样品实验时，设备能够自动取到不同位置的样品。

注射泵上标号1的阀孔连接至光路准直调节台样品室的上导管处，实验开始时，控制注射泵将样品暂存室中的样品抽到样品室中心。样品蠕动开始后，控制软件自动开启快门和探测器进行数据采集。实验完成后，控制注射泵排液至对应的样品室中完成回收样品功能；也可以调节暂存室样品台的位置，使废液孔移至下导管处，控制注射泵排液至废液孔，完成不回收功能。

2.2软件设计

计算机运行在Linux系统下，使用EPICS平台及第三方编程语言python设计并开发样品蠕动装置的控制程序。

为便于用户操作样品蠕动装置软件，专门设计参数设置模块，可以设置的参数包括阀门位置、实验样品体积、抽取样品后需要抽取空气的体积、冲洗体积、冲洗次数、样品蠕动速度、空气冲洗速度、水冲洗速度、抽取样品速度等。由于测试过程中样品需要持续蠕动，高通量同步辐射光可以照射到样品不同位置，导致单位体积样品的曝光时间减小，样品所受辐射损伤降低，所以在参数设置模块需要设定样品蠕动速度。

蠕动装置控制软件在样品准备好后可以通过网络触发探测器和快门进行数据采集及数据保存。探测器控制软件是利用synApps的areaDetector模块在EPICS平台下进行编译及改进。快门控制器控制快门，快门控制器通过RS232转网络设备实现与计算机的网络通信。通过编写快门的Softioc并后台运行，使用探测器数据采集界面上的shutter控制按钮可以实现探测器与快门的同步。探测器和电离室数据保存文件的格式为样品名_曝光时间_序列号。

溶液样品蠕动装置控制系统的软件设计采用了模块化[11]设计方案，主要包含以下10个模块：1）变量定义模块；2）参数设置模块；3）函数定义模块；4）主程序模块；5）电机控制模块（带编码器）；6）注射泵控制模块；7）实验模块；8）冲洗模块；9）回收样品模块；10）电离室数据的自动保存模块。

PSD/4注射泵采用RS232通讯接口，采用5mL注射器和八孔阀。溶液样品蠕动装置控制软件模块如图3所示。

图3　溶液样品蠕动装置控制软件模块Fig.3　Modules　of　control　software　for　solution　peristaltic　device.

为方便用户选择从第几个样品开始实验到第几个样品结束实验，所以在程序界面上设置了From 和To的选择。实验开始首先进行两者大小的比较，以便决定是做Buffer实验、样品实验还是两者同时实验。主程序流程图如图4所示。

本程序的关键部分是实验模块，实验模块主要实现注射泵和电动台的协调控制、样品蠕动和触发探测器等功能。

用户操作界面使用CSS开发，界面友好且操作简单。界面显示包括样品装置控制部分、Pilatus探测器控制部分和电离室数据显示及曲线显示部分。其控制界面如图5所示。

图4　样品蠕动装置主程序流程图Fig.4　Main　flow　diagram　of　the　solution　peristaltic　device.

图5　样品蠕动装置控制界面Fig.5　Interface　of　control　software　for　the　solution　peristaltic　device.

2.3样品蠕动装置测试

控制软件完成后，对软件的性能进行了测试，验证了系统功能。

为进行该装置的防辐射损伤效果实验，实验前把该装置安装在SSRF的BL19U2以进行SAXS测试。探测器采用的是Pilatus1M，实验选取的入射光能量为12keV，通量约为4.0×1012，样品到探测器距离为1350mm。

按照SSRFBL16B1实验站测试样品蠕动装置的实验方法[12]在BL19U2实验站上做了验证实验，实验方法如下：实验前先将溶菌酶蛋白（Lysozyme FromHenEggWhite，Fluka）纯化，并溶于20mmol·L-1Tris-Base、100mmol·L-1NaCl及5%甘油的缓冲溶液中，配成浓度为8.5mg·mL-1的溶液。在静止和蠕动两种模式下，分别连续曝光10次，曝光时间为2s。散射曲线（散射强度I-散射矢量q）如图6所示，曝光顺序依次为图示中的从下到上。由图6（b）可见，在静止模式下，随着曝光次数的增加，在低q区的散射曲线出现上扬，相应的Guinier图斜率变大，溶菌酶蛋白逐渐发生集聚[13]；由图6（a）可见，样品在蠕动模式下，散射曲线几乎不随曝光次数增加而变化，低q区散射曲线重合，相应的Guinier图斜率几乎不变，样品未发生明显集聚。将两种模式测得的溶菌酶回旋半径值示于图7，在蠕动模式下，溶菌酶回旋半径基本不随曝光次数变化。此外，将蠕动模式下曝光10次测得的散射曲线平均，并与标准散射曲线相比较结果示于图8。

图6　8.5　mg·mL-1溶菌酶在蠕动（a）和静止（b）两种模式下测得的散射曲线Fig.6　Scattering　curves　obtained　from　8.5　mg·mL-1　lysozyme using　stationary　collection　mode　（a）　and　peristaltic　collection mode　（b）.

图7　静止模式和蠕动模式下回旋半径随曝光时间的变化（标准溶菌酶参考值1.52±0.1）Fig.7　The　change　of　gyration　radii　with　the　exposure　time measured　in　stationary　mode　and　peristaltic　mode　（the　Gyration radius　of　standard　lysozyme　is　1.52±0.1）.

图8　蠕动模式下曝光10次所得平均散射与标准散射曲线Fig.8　Average　scattering　curves　obtained　from　10　times peristaltic-collection　mode　exposure　and　standard　scattering curves.

3　结语

为验证蠕动装置的防辐射损伤效果，本文在一次实验中采取了静止曝光和蠕动曝光两种曝光模式，通过对比两种曝光模式下样品的散射曲线及回旋半径，可以分析得出样品在蠕动曝光模式下受到的辐射损伤程度明显降低。

然后，将蠕动模式下曝光10次测得的溶菌酶平均散射曲线与标准散射曲线相比较，可知在q值小于4的范围内两个散射曲线基本重合，说明该蠕动测量装置不仅可以准确地得到样品的散射信息，而且也抑制了蛋白质的集聚。

该装置使用的样品体积小，控制精度高。实验结果表明，该溶液蠕动装置有效减小了X射线在测量过程中对蛋白质样品的损坏，该装置硬件及其控制软件的研制满足实验要求。

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收稿日期：2015-10-26，修回日期：2015-12-29

Correspondingauthor:BIANFenggang，E-mail:bianfenggang@sinap.ac.cn

通信作者：边风刚，E-mail:bianfenggang@sinap.ac.cn

DOI:10.11889/j.0253-3219.2016.hjs.39.010102

中图分类号TP273＋.5