鸡血藤醇提物及其活性成分儿茶素抗辐射作用及机制研究

谭潇 董宪喆 郭代红 王石 李牧函 赵润清 刘屏

[摘要]研究雞血藤乙醇提取物及其活性成分儿茶素的抗辐射作用，并探讨初步作用机制。采用6Gy 60Coγ射线一次性全身照射ICR小鼠造成亚急性辐射损伤模型， 随机分为正常组、模型组、阳性对照组（氨磷汀，436 mg·kg-1，iv）、鸡血藤组（生药10，20，40 g·kg-1）、儿茶素组（50，100，200 mg·kg-1），连续ig给药28 d，每日1次。检测给药前1 d及给药1，3，7，14，21，28 d后小鼠外周血WBC，RBC，PLT计数和HGB含量；观察给药7 d后小鼠胸腺及脾脏指数的变化；比色法测定给药7 d血清SOD，GSHPx活性和MDA水平；采用半固体培养基测定给药7 d后骨髓造血祖细胞集落形成能力；HE染色观察给药7，14 d股骨骨髓病理学改变；流式细胞术检测给药7 d后骨髓细胞的凋亡，Western blot测定骨髓细胞中cleaved caspase3和Bcl2的表达，免疫组化法检测股骨骨髓中Bax的表达。结果表明，鸡血藤醇提物和儿茶素均可促进辐射小鼠外周血象的恢复，增加免疫器官胸腺和造血器官脾脏的脏器指数，提高血清抗氧化酶SOD和GSHPx活性、降低MDA水平，促进骨髓造血祖细胞的增殖分化；增加骨髓腔内细胞数量、减轻立体支架结构损伤，改善造血微环境；抑制骨髓细胞凋亡，使凋亡相关蛋白Bcl2的表达显著上调，cleaved caspase3和Bax的表达显著下调。鸡血藤醇提物和儿茶素对亚急性辐射损伤小鼠有明显的保护作用，其机制与促造血、抗氧化、抗凋亡作用有关。

[关键词]鸡血藤；儿茶素；辐射损伤；外周血象；造血祖细胞；细胞凋亡

[Abstract]To study the antiradiation effect and mechanism of ethanol extracts from Spatholobus suberectus and its active component catechin， ICR mice were exposed to 6Gy irradiation and randomly divided into normal group， model group， positive control group （amifostine， 436 mg·kg-1， iv 30 min before irradiation）， SSD group （10， 20， 40 g·kg-1） and catechin group （50， 100， 200 mg·kg-1） The mice were administered the appropriate drugs once a day after irradiation for 28 consecutive days Blood samples were collected from the tail end and the number of peripheral blood cells was counted before irradiation and on day 1， 3， 7， 14， 21 and 28 using a microcell counter Changes of thymus and spleen index of mice on day 7 were observed The serum SOD， GSHPx activity and MDA level were detected by the colorimetric method The colony forming ability of bone marrow hematopoietic progenitor cells on day 7 was detected by semi solid culture method The HE staining was adopted to observe the pathological changes The apoptosis of bone marrow cells was detected by flow cytometry The expression of cleaved caspase3 and Bax of bone marrow cells were measured separately by westernblotting and immunohistochemistry method SSD and catechin can both significantly revert the irradiatedinduced decline in hematological parameters （RBC， WBC， PLT， Hb）， improve thymus and spleen index， significantly enhance serum SOD and GSHPx activity and decrease the MDA level The proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells in bone marrow were promoted， the apoptosis of bone marrow cells was significantly upregulated and the expression of cleaved caspase3 and Bax was significantly reduced in SSD and catechin group SSD and catechin have significant antiradiation effect and its mechanism may be related to hematopoietic promoting， antioxidant and antiapoptotic effects

[Key words]Spatholobus suberectus； catechin； irradiation injury； peripheral blood； hemopoietic progenitor cell； cell apoptosis

doi：10.4268/cjcmm20160924

辐射可直接导致多种DNA损伤，造成基因突变和染色体畸变；又会使机体产生大量内源性自由基，引发脂质过氧化，损伤组织器官[1]。辐射危害累及血液、免疫、消化、生殖等多个系统，甚至会诱发癌症[2]。临床上约70%的恶性肿瘤病人需放射治疗，但放疗后造成的骨髓抑制、造血功能障碍、外周血细胞下降、免疫功能受损等已成为制约其疗效的瓶颈[3]。从天然中草药中寻找毒性低、不良反应少的抗辐射作用有效成分具有重要意义。

鸡血藤为豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎，有补血活血、调经止痛、舒经活络的功效，临床上主治月经不调、风湿痹痛、麻木瘫痪、血虚萎黄等[4]。课题组以往研究表明[56]，鸡血藤乙醇提取物用乙酸乙酯萃取后，经色谱柱分离得到9个化合物，以儿茶素含量最多，其次为没食子儿茶素、表儿茶素等，并且儿茶素刺激造血祖细胞增殖作用最强，可通过诱导IL6和 GMCSF mRNA 的表达，使骨髓细胞跳出“G1期阻滞”进入增殖周期。本实验通过检测小鼠外周血象、脏器指数、抗氧化指标、造血祖细胞增殖、骨髓病理学改变、骨髓细胞凋亡及凋亡相关蛋白cleaved caspase3，Bcl2，Bax的表达变化，从促造血、抗氧化、抗凋亡3个方面探讨鸡血藤醇提物和儿茶素抗辐射作用及初步分子机制。

1材料

鸡血藤中药饮片（北京绿野药业有限公司，产地福建）；儿茶素（Sigma公司）；注射用氨磷汀（大连美罗大药厂，04 g/支）；MethoCult M3434培养基（Stemcell公司）；RPMI 1640培养基，胎牛血清（HyClone公司）；红细胞裂解液（Solarbio公司）；超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX），丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物技术研究所）；细胞凋亡检测试劑盒（凯基生物）；cleaved caspase3，Bcl2抗体（美国Cell Signaling technology公司）；Bax抗体（SANTA CRUZ）；βactin和相应的二抗（美国Abcam公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

SPF级ICR小鼠，6～8周，18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）20120001。实验在动物适应环境1周后正式进行。

BC2800Vet兽用全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；60Coγ钴源（军事医学科学院）；MCO15AC二氧化碳培养箱（日本SANYO公司）；IX51荧光倒置生物显微镜（日本OLYMPUS公司）；VICTOR3多标记微孔板分析仪（美国PerkinElmer公司）；ABJ804NM电子天平（德国KERN）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD）；电泳仪，半干槽（美国BioRad）；UVP凝胶成像系统（美国EC3 Imaging Systems）。

2方法

21鸡血藤乙醇提取物制备

鸡血藤中药饮片，8倍量体积75%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并滤液，减压旋蒸至浸膏，冻干，得鸡血藤乙醇提取物粉末（SSD）。

22分组与给药

将健康ICR小鼠216只，雌雄各半，随机分为正常组、模型组、阳性对照组（氨磷汀，436 mg·kg-1，照射前30 min尾静脉注射给药）、鸡血藤组（生药浓度10，20，40 g·kg-1）、儿茶素组（50，100，200 mg·kg-1），每组24只。除正常组外，各组均接受60Gy剂量60Coγ射线一次性全身照射（剂量率11729 cGy·min-1，时间4 min 50 s）。自照射当日起， 每只灌胃给予相应药物02 mL，正常组、辐射组给予等量生理盐水，每日1次，连续给药28 d。

23外周血象检测

于照射前及给药1，3，7，14，21，28 d后剪尾尖采血20 μL，测定外周血白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）计数及血红蛋白（HB）水平，观察给药28 d内小鼠外周血象的变化。

根据外周血象结果，分别选择鸡血藤组和儿茶素组中促进外周血象恢复作用最佳的剂量组，观察其对抗氧化、造血祖细胞增殖、骨髓病理学、骨髓细胞凋亡及抗体表达等的影响，进行作用机制的研究。

24脏器指数和抗氧化指标测定

给药7 d后取每组动物的胸腺、脾脏，称重，计算脏器指数。脏器指数=器官质量/体重×1 000。同时摘眼球取血，分离血清，按照试剂盒说明书方法测定给药7 d后小鼠血清中SOD，GSHPX活性和MDA水平。

25HE染色检测股骨骨髓病理改变

给药7，14 d后，各取每组动物单侧股骨，剥离肌肉组织后于4%多聚甲醛固定24 h，脱钙，常规石蜡包埋，切片，苏木精伊红染色，光学显微镜下观察股骨骨髓病理形态学改变。

26造血祖细胞集落培养

给药7 d后各取每组动物单侧股骨，吸取RPMI 1640培养基冲出骨髓至培养皿中，正反各冲洗3次，直至冲洗液变清亮后停止。冲出的骨髓细胞1 000 r·min-1离心5 min，去上清，加入红细胞裂解液裂解15 min，1 000 r·min-1离心10 min，去上清，用RPMI 1640完全培养基重悬，得骨髓单个核细胞，细胞计数。取5×104个细胞于6孔板中，每孔加入15 mL M3434培养基，每组设6个复孔，置37 ℃，5%CO2培养箱中培养，于第10天记录粒细胞巨噬细胞集落形成单位（CFUGM）、爆式红细胞集落形成单位（BFUE）和混合细胞集落形成单位（CFUMix）集落数，多于50个细胞判为一个集落。

27流式细胞术检测骨髓细胞凋亡

方法同上制得骨髓单个核细胞。每组取5×105细胞，用PBS洗涤2次（2 000 r·min-1离心5 min），加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，加5 μL Annexin VFITC混匀后，再加5 μL PI，混匀，室温避光反应15 min，在1 h内上机检测。

28Western blot法检测cleaved caspase3的表达

将27项中每组剩余的骨髓单个核细胞用PBS洗涤2次，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂充分裂解，4 ℃，12 000 r·min-1离心30 min。取上清，BCA试剂盒蛋白定量，细胞总蛋白加上样缓冲液煮沸变性。用10% SDSPAGE分离蛋白，转膜后用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温杂交2 h，洗膜后，加入ECL发光液，进行检测。

29免疫组化法检测Bax的表达

将25项中小鼠股骨骨髓蜡块切片，烘干，逐步脱蜡和水化，而后进行抗原修复，滴加山羊血清于37 ℃温箱中封闭20 min。取出切片加一抗Bax，4 ℃冰箱孵育过夜，再加入二抗37 ℃温箱孵育30 min，DAB显色复染后脱水，封片，晾干。切片随机选10个视野于400倍光学显微镜下观察阳性细胞分布程度，用Image Pro软件进行半定量分析，Bax的蛋白表达以IOD值表示。

210数据统计

实验数据用SPSS 170统计软件处理，结果均用±s表示，多组间比较采用单因子方差分析，P<005表示有显著性差异。

3结果

31鸡血藤醇提物和儿茶素对辐射小鼠外周血象的影响

与正常组比，辐射组小鼠WBC，RBC，PLT，HGB水平均有所下降，而鸡血藤醇提物组和儿茶素小鼠外周血象均有不同程度的改善，其中鸡血藤醇提物和儿茶素高剂量组对小鼠外周血象恢复的作用最好。儿茶素高剂量组WBC从第7天，鸡血藤高剂量组从第21天起明显高于辐射组（P<001），至第28天仍有显著性差异。鸡血藤高剂量组RBC从第7天，儿茶素高剂量组从第14天开始明显高于模型组（P<001），至第28天接近正常组水平。鸡血藤高剂量组PLT從第14天到第21天，儿茶素高剂量组从第7天到第21天明显高于模型组（P<001）。鸡血藤儿茶素高剂量组HGB均从第7天到第21天显著高于模型组（P<001）（图1）。

32外周血象恢复作用最好的鸡血藤醇提物组和儿茶素组促造血、抗氧化、抗凋亡作用

321对脏器指数的影响给药7 d后，模型组与正常组比，脾脏指数和胸腺指数均显著降低

323对小鼠股骨骨髓病理学影响HE染色显示，给药7 d后，正常组小鼠骨髓结构完整，骨髓细胞密集，充满于骨髓腔内，造血细胞增殖活跃；模型组骨髓细胞大量减少，仅残存少量有核细胞，核染色质固缩或碎裂，骨髓网状纤维结构的立体支架破碎，呈现空洞状；与模型组比，鸡血藤组和儿茶素组中骨髓细胞数有所增多，细胞核固缩减轻，空洞状结构减少，立体支架结构损伤程度减轻；给药14 d后，鸡血藤组和儿茶素组骨髓结构改善更加明显，骨髓细胞数显著增多，可见明显的造血细胞再生灶，立体支架结构逐渐恢复（图2）。

324对造血祖细胞集落形成的影响给药7 d后，模型组小鼠骨髓造血祖细胞增殖能力明显受到抑制，CFUGM，BFUE和CFUMix数量与正常组比显著降低（P<005）。与模型组比，鸡血藤组小鼠骨髓形成CFUGM，BFUE和CFUMix的数量显著

4讨论

目前抗辐射药物主要包括含硫化合物、激素类、细胞因子等[7]。含硫化合物抗辐射作用最强，但毒副作用明显；细胞因子在促进造血干细胞（hemato

增殖和分化的同时也消减了其自我更新能力，加速HSCs的耗竭，加重骨髓远期损伤[89]。目前，国内外学者发现许多天然药物成分如多糖、生物碱、黄酮类等有一定的抗辐射损伤作用，可作用于不同时期的造血干/祖细胞，在蛋白质和基因水平参与增殖分化的调控，促进骨髓造血功能重建。由于中药还具有药源广、毒性作用低等特点，中药抗辐射活性成分的研究已成为近年来的热点。

鸡血藤为我国传统中药，课题组通过前期研究[1011]，阐明了鸡血藤的主要活性部位，从中提取、分离、鉴定了以茶多酚类化合物为代表的主要活性成分，如儿茶素（catechin），表儿茶素（epicatechin），没食子儿茶素（gallocatechin），表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）等化合物，单体中活性最强的是儿茶素。儿茶素在植物中分布广泛，以豆科、茜草科、蔷薇科、山茶科居多，可有效清除人体内多种自由基，延缓衰老。绿茶中也含有丰富的儿茶素类成分，其抗辐射作用多有研究报道[12]。造血系统，尤其骨髓是电离辐射主要的靶器官之一，机体受辐射后最明显的变化是外周血象的降低。本研究结果显示，辐射后小鼠WBC，RBC，PLT，HGB水平均有不同程度下降，其中降低最为显著的为WBC。与辐射组比，鸡血藤组和儿茶素组可以加速外周血象各项指标的恢复。外周血象的变化提示从给药7 d起，各给药组与辐射组WBC，RBC，PLT，HGB均开始有显著性差异，给药7 d左右是血象恢复的关键点，因此本文选择给药7 d的时间点研究其促造血、抗氧化、抗凋亡的作用。

造血干细胞是原始的全能造血细胞，可进一步分化为各系造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPCs），进而在特定造血微环境及造血调控下增殖分化为各类血细胞[13]。骨髓造血祖细胞集落培养实验中集落形成数量可在一定程度上反映造血祖细胞的内在增殖活力[14]。本实验结果显示，与辐射组比，鸡血藤组和儿茶素组可显著提高骨髓造血祖细胞CFUGM和BFUE的集落形成能力，儿茶素组更易促进CFUGM的形成，而鸡血藤组更易促进BFUE的形成，这与7 d后外周血象的变化相符。骨髓病理学结果显示，给药7 d后，鸡血藤组和儿茶素组骨髓损伤已经有所减轻，给药14 d后，骨髓细胞数显著增多，造血细胞增殖活跃，骨髓微环境明显改善。因此，鸡血藤醇提物和儿茶素具有明显的促进辐射小鼠造血功能恢复的作用。

辐射还会诱导机体产生大量的自由基，導致机体的抗氧化体系失去平衡，破坏DNA结构，损伤造血系统、免疫系统等，还可攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸而引起脂质过氧化，导致细胞代谢障碍[15]。研究发现[16]，辐射后机体中活性氧（reactive oxygen species， ROS）升高，会使造血系统应激能力下降而出现HSCs衰老，影响造血功能。体内SOD，GSHPx等能清除自由基，MDA是脂质过氧化的产物，三者的水平可间接反映出细胞氧化损伤的程度[17]。本研究发现，鸡血藤醇提物和儿茶素均能不同程度地降低辐射引起的MDA含量升高，提高血清SOD，GSHPx活性，减轻氧化损伤；同时，使造血器官脾脏和免疫器官胸腺的脏器指数增加，说明对造血和免疫系统也有一定的保护作用。

caspase3是调控细胞凋亡的关键蛋白，细胞凋亡的最后通路均与caspase3的活化有关[18]。caspase3的激活需要从没有活性的全长35 kDa剪切有活性的17 kDa亚基和13 kDa亚基，即cleaved caspase3[19]。Bcl2和Bax是线粒体凋亡信号通路中的主要蛋白，线粒体途径过程中，Bcl2被抑制而Bax和Bak等凋亡蛋白释放，移位插入到线粒体外膜的Bax可引起线粒体膜通透性改变，促进细胞色素c的释放，激活Apaf1，caspase9和caspase3，引起细胞形态学改变导致细胞凋亡[2021]。本研究发现，辐射可导致骨髓细胞中cleaved caspase3和Bax的表达上调，促进骨髓细胞凋亡。与辐射组比，鸡血藤组和儿茶素组在下调cleaved caspase3和Bax，上调Bcl2表达方面有显著性差异，鸡血藤组下调2种蛋白的表达更明显，这与鸡血藤组骨髓细胞凋亡率最低也相一致。

综上所述，鸡血藤醇提物和其活性单体儿茶素可通过提高造血祖细胞内在增殖活力促进造血，改善外周血象；又可通过提高血清抗氧化酶活性，减少脂质过氧化物产生，减轻机体氧化损伤；还能下调cleaved caspase3和Bax的表达，上调Bcl2的表达抑制骨髓细胞的凋亡。本文从促造血、抗氧化、抗凋亡3个方面探讨了鸡血藤和儿茶素的抗辐射作用及其初步机制，但具体通过哪种通路发挥了造血调控还需进一步研究。

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[責任编辑马超一]