枸杞对小鼠辐射损伤后造血系统修复的促进作用

研究报告

枸杞对小鼠辐射损伤后造血系统修复的促进作用

石桂英， 白琳

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京100021)

【摘要】目的探讨枸杞在小鼠辐射损伤后造血系统修复过程中的作用。方法小鼠随机分为3组，正常对照组不做任何处理，喂饲正常饲料；另外2组，给予4.5 Gy照射后，喂饲正常饲料或添加枸杞的饲料，1个月后，处死小鼠，应用流式细胞仪分析外周血、脾脏、胸腺及骨髓中各种血细胞。结果枸杞饲料组小鼠，外周血细胞总数及B细胞增多，骨髓细胞总数减少，骨髓前体B细胞及未成熟B细胞增多，造血干、祖细胞均显著减少。结论枸杞促进辐射损伤后造血干细胞动员及分化，加速造血系统的恢复。

【关键词】枸杞 辐射损伤 流式细胞术 造血干祖细胞

[基金项目]国家自然科学基金青年科学

[作者简介]石桂英，女，主管技师，研究方向：衰老与再生。

[通讯作者]白琳，bailin49@163.com。

【中图分类号】R33【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.010

Promoting effect ofLyciumchinenseMill on hematopoietic

reconstruction in mice after radiation injury

SHI Gui-ying，Bai Lin

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,

Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health, Beijing 100021, China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of Lycium chinense Mill on hematopoietic reconstruction in mice after radiation injury. MethodFemale C57BL/6J mice were grouped to 3 groups at random: the control group, with normal food and no treatment, and the other 2 groups, treated with 4.5 Gy irradiation, with normal food or food added with Lycium chinense Mill. After 1 month, the mice were sacrificed and analyzed the peripheral blood, spleen, thymus and bone marrow cells by flow cytometer. Results In the mice fed with Lycium chinense Mill, the percentage of B cells was increased in the peripheral blood, the pre-B and immature B cells were increased, too, and the percentage of hematopoietic stem/progenitor cells was decreased. Conclusion Lycium chinense Mill can promote the mobilization and differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells, and accelerate the hematopoietic reconstruction after irradiation injury.

【Key words】LyciumchinenseMill; Radiation injury; Flow cytometer; Hematopoietic stem/progenitor cells; Mice

枸杞是常用滋补性中药，具有滋补和增强免疫功能的作用，广泛用于抗衰老、抗肿瘤及抗心血管等疾病[1-4]。可以促进骨髓细胞增殖，刺激造血系统，促进白细胞增高。研究认为，枸杞含有多糖、核黄素、烟酸等化学成分，具有较强的生理活性，如抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖、降血脂等。本研究主要探讨枸杞在小鼠辐射损伤后造血系统修复过程中的作用。造血干细胞在造血系统修复中起重要作用，是各种血细胞的来源，同时其自我更新能力维持造血干细胞的数量，以及造血系统的稳定状态[5-7]。本研究分析了造血系统各种细胞的变化以及造血干细胞的改变。

1材料和方法

1.1动物与设备

实验所用动物为2月龄C57BL/6J雌性小鼠，共30只，购自北京华阜康生物科技有限公司。每组10只，小鼠饲养在SPF动物房内，动物生产及使用许可证号：SCXK(京)2009-007、SYXK(京)2011-0022。主要实验设备为美国BD公司Aria流式细胞仪。

1.2中药喂养

将小鼠随机分为正常对照组、4.5 Gy照射+正常饲料组、4.5 Gy 照射+枸杞饲料组。正常对照组小鼠，不进行照射，同时喂饲正常小鼠SPF维持料；4.5 Gy照射+正常饲料组，给予小鼠总剂量4.5 Gy照射后，喂饲正常小鼠SPF维持料；4.5 Gy照射+枸杞饲料组，给予小鼠总剂量4.5 Gy照射后，喂饲加入枸杞的饲料。药物剂量按成人与小鼠之间剂量换算系数计算，每只小鼠每天摄食量为3 g，小鼠摄入枸杞的剂量为100 mg/kgd。按上述换算所得数据，在常规小鼠饲料中加入相应剂量的枸杞配制成枸杞饲料。

1.3流式分析

从小鼠眼眶静脉丛取外周血100 μL，加红细胞裂解液，充分混匀，室温静置5 min裂解红细胞，离心后PBS缓冲液重悬备用。小鼠脱颈椎处死，取脾脏、胸腺及后肢骨，置于冰上预冷的PBS缓冲液中。用磨砂玻片将脾脏、胸腺分别研磨成细胞悬液；后肢骨用研钵压碎，加6 mL PBS缓冲液反复吹打，制成细胞悬液。将上述细胞悬液用300目尼龙膜过滤后收集到15 mL离心管中，取10 μL细胞悬液，用PBS缓冲液稀释10倍后计数。细胞悬液离心，1000 rpm，10 min，用PBS缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度为1×108个细胞/mL。取106细胞标记荧光抗体(eBioscience公司)。

造血干细胞标记抗体为：B220-biotin、CD4-biotin、CD8-biotin、Mac-1-biotin、Gr-1-biotin、Ter-119-biotin、Mac-1-biotin、IL-7R-biotin、CD34-FITC、CD16/32- Pcrcp-cy5.5、Flt3-PE、Sca1- E-Cy7、cKit-APC、biotin-APC-Cy7。造血干细胞(LSK)表面标记为：lin- sca1+c-kit+，CD34-Flt3-Lin- Sca1+c-Kit+标记长期造血干细胞(LT-HSC)， CD34+Flt3-Lin- Sca1+c-Kit+标记短期造血干细胞(ST-HSC)，CD34+Flt3+Lin- Sca1+c-Kit+标记多潜能祖细胞(MPP)，Lin- Sca1-c-Kit+标记髓系祖细胞(MP)，CD34+CD16/32lowLin-Sca1-c-Kit+标记共同髓系祖细胞(CMP)， CD34+CD16/32highLin-Sca1-c-Kit+标记粒单系祖细胞(GMP)，CD34-CD16/32lowLin-Sca1-c-Kit+标记巨核单系祖细胞(MEP)。骨髓B淋巴细胞标记的抗体有：B220-PE-Cy7、CD43-PE、IgD-FITC、IgM-APC，根据表面标记不同，B淋巴细胞可分为不同的发育阶段。CD4-FITC、CD8- Pcrcp-cy5.5、B220-PE-Cy7、CD11B- APC-Cy7标记骨髓、脾脏、外周血中的T、B淋巴细胞及髓系细胞。胸腺细胞用CD4-FITC、CD8- Pcrcp-cy5.5标记。分别配制上述抗体混合液加入细胞悬液，冰上避光，30 min；加1 mL PBS缓冲液，离心，2600 rpm，5 min，弃上清液，加200 μL PBS缓冲液重悬细胞，用300目尼龙膜过滤，冰上避光备用。

1.4统计学方法

采用GraphPad Prism软件包进行数据统计分析，各组数据均采用-x±s表示。组间资料分析采用t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1枸杞对外周血细胞的影响

小鼠4.5 Gy照射后，喂饲正常饲料或枸杞饲料1个月后，取外周血计数，流式分析B细胞 (B220+)、粒细胞 (CD11b+)及T (CD4+/CD8+)细胞，发现照射后小鼠外周血细胞显著减少，与正常饲料组相比，枸杞饲料组小鼠外周血细胞总数显著增多(图1A)，B细胞比例显著升高(图1B)。可见，枸杞促进外周血细胞总数及B细胞恢复。

图1　外周血计数及B、粒、T淋巴细胞的比例 Fig.1　Number of cells and percentage of B, myeloid, T cells in the peripheral blood

2.2枸杞对骨髓及脾脏血细胞的影响

同时，我们取小鼠的骨髓和脾脏细胞，流式分析B、粒及T细胞，发现照射后B细胞比例无显著变化，粒细胞比例升高，而T细胞比例下降，枸杞饲料组与正常饲料组无显著差异(图2)。可见，枸杞对骨髓、脾脏血细胞无显著影响。

图2　骨髓及脾脏中B、粒、T细胞比例 Fig.2　Percentage of B, myeloid, T cells in the bone marrow and spleen

2.3枸杞对骨髓前体B细胞的影响

B细胞是在骨髓中发育成熟的，枸杞饲料组小鼠外周血B细胞显著高于正常饲料组，枸杞可能影响了骨髓中B细胞的发育，为此，我们分析了骨髓前体B细胞的发育。结果发现，照射后骨髓前体B细胞及未成熟B细胞显著增多，成熟B细胞显著减少(图3)。与正常饲料组相比，枸杞饲料组骨髓前体B细胞及未成熟B细胞显著增多，成熟B细胞显著减少。由此可见，枸杞促进成熟B细胞进入血液，增强机体免疫力。

图3　骨髓中不同发育阶段B细胞比例 Fig.3　Percentage of different stage B cells in the bone marrow

2.4枸杞对胸腺细胞的影响

T细胞在胸腺中发育成熟。胸腺T细胞可以分为几个阶段，双阴性细胞(CD4-CD8-)、双阳性细胞(CD4+CD8+)、单阳性细胞(CD4+或CD8+)。分析发现，照射后胸腺单阳性细胞显著减少，双阴性细胞显著增加，双阳性细胞比例升高，但没有显著性(图4)。与正常饲料组相比，枸杞饲料组CD4+细胞增多。这说明，枸杞可能促进胸腺细胞发育为CD4+细胞。

图4　胸腺中各种细胞的比例 Fig.4　Percentage of different cells in the thymus

2.5枸杞对造血祖细胞的影响

为了进一步了解辐射损伤修复过程中枸杞的作用，我们分析了造血祖细胞的变化。结果表明，辐射损伤后淋系共同祖细胞增多，而髓系共同祖细胞没有显著变化，粒-单核祖细胞显著减少。与正常饲料组相比，枸杞饲料组，淋系共同祖细胞减少，但没有显著性；髓系共同祖细胞明显减少，粒-单核祖细胞及巨核-红系祖细胞无显著变化(图5)。这说明，枸杞促进髓系共同祖细胞的分化。

备注：CMP：髓系共同祖细胞，GMP：粒-单核祖细胞，MEP：巨核-红系祖细胞 图5　骨髓中造血祖细胞的比例 Note: CMP: Common myeloid progenitor cells; GMP: Granulocyte-macrophage progenitor cells; MEP: Megakaryocyte-erythrocyte progenitor cells. Fig.5　Percentage of hematopoietic progenitors in the bone marrow

备注：LSK：lin-sca1 +c-kit +造血干细胞，LT-HSC：长期造血干细胞，ST-HSC：短期造血干细胞，MPP：多潜能造血祖细胞 图6　骨髓细胞数及造血干细胞的比例 Note. LSK: lin-sca1 +c-kit +: Hematopoietic stem cells; LT-HSC: Long term hematopoietic stem cells; ST-HSC: Short term hematopoietic stem cells; MPP: Multipotential progenitor cells. Fig.6　Percentage of hematopoietic stem cells in the bone marrow

2.6枸杞对造血干细胞的影响

为了确定半致死剂量辐射30天后小鼠骨髓细胞的变化，我们取小鼠一只后肢的股骨、胫骨的骨髓细胞进行计数，发现此时小鼠骨髓细胞较正常野生型小鼠偏低，但差异无显著性。与正常饲料组相比，枸杞饲料组细胞数显著减少(图6A)。对三组小鼠骨髓造血干细胞的分析结果显示，辐射损伤后，小鼠造血干细胞(lin-sca1+c-kit+，LSK)减少，枸杞饲料组显著低于对照及正常饲料组(图6B)。骨髓中造血干细胞/祖细胞的比例的降低，可能的原因包括：造血干细胞/祖细胞自我更新能力降低，造血干细胞/祖细胞分化能力增强，或者造血干细胞动员增加。外周血中造血干细胞的比例是否增加是衡量造血干细胞动员的关键指标之一，为此，我们分析了各组外周血中的造血干细胞。结果显示，

与对照组相比，辐射后正常饲料及枸杞饲料组外周血中造血干细胞比例显著升高，枸杞饲料组又显著高于正常饲料组(图6B)，这说明辐射损伤动员造血干细胞，枸杞也促进了骨髓造血干细胞的动员。同时，枸杞饲料组骨髓长期造血干细胞、短期造血干细胞及多潜能祖细胞均显著减少(图6C)，而淋系及髓系共同祖细胞显著增多(图5)，说明枸杞促进造血干细胞的分化。

3讨论

枸杞是常用滋补性中药，具有滋补和增强免疫功能的作用，具有广泛用途。枸杞多糖是枸杞中最主要的活性成分，具有促进免疫、抗衰老等多种功能[1-4]。甜菜碱是枸杞中主要的生物碱之一，在脂质代谢中有重要作用。枸杞色素是存在于枸杞浆果中的各类呈色物质，是枸杞籽的重要生理活性成分，很多研究证明枸杞色素具有提高人体免疫功能、预防和抑制肿瘤及预防动脉粥样硬化等作用[8]。本研究发现，枸杞在辐射损伤后造血系统的修复中起重要作用。枸杞可以动员骨髓造血干细胞进入外周血，同时促进其分化为各系造血祖细胞，并促进成熟B细胞进入血液，加快辐射损伤后成熟血细胞水平的恢复，提高机体免疫功能。

参考文献：

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〔修回日期〕2014-11-04