黄连解毒汤对小鼠酒精性脂肪肝的预防作用

研究报告

黄连解毒汤对小鼠酒精性脂肪肝的预防作用

王睿林1，李晓娟2，白云峰1，王立福1，李蓓2，李永纲1，李瑞生2

(1. 解放军第302医院中西医结合肝病诊疗与研究中心，北京100039；

2. 解放军第302医院实验技术研究保障中心，北京100039)

【摘要】目的研究黄连解毒汤(HLJDT)对小鼠酒精性肝损伤的预防作用，为黄连解毒汤临床防治酒精性肝病提供实验依据。方法选取60只C57小鼠随机分为空白对照组、模型对照组和HLJDT低、中、高剂量(0.61、1.22、2.44 g/kg/d)模型组，每组各12只。模型组用50%乙醇灌胃，同时采用HLJDT进行实验干预，6周后，对各组小鼠的体质量、肝指数、血清生化指标以及肝脏和结肠的病理学改变进行综合对比分析。结果HLJDT各剂量模型组小鼠的体重增长量均显著增加(P<0.05)，肝指数明显降低(P<0.05)，同时HLJDT各剂量模型组能显著降低血清ALT、AST和TG的含量(P<0.05)。病理结果显示HLJDT各剂量均对酒精性肝损伤有显著的改善作用，且从低剂量到高剂量组对肠粘膜通透性具有递增的改善作用。结论黄连解毒汤可显著降低肠粘膜的通透性，对小鼠酒精性肝损伤具有一定的预防保护作用。

【关键词】黄连解毒汤；酒精性脂肪肝；小鼠

[基金项目]解放军第302医院院长创新基金(YNKT2013026)。

[作者简介]王睿林(1979-)，男，博士，主治医师，从事中西医结合治疗研究，E-mail： wrl7905@163.com；李晓娟(1980-)，女，硕士，E-mail： sxlily55@163.com。并列为第一作者。

[通讯作者]李瑞生(1969-)，男，博士，副研究员，从事人类疾病动物模型研究，E-mail： lrsheng@sohu.com；李永纲(1965-)，男，硕士，主任医师，从事传染病学研究，E-mail： lyg100039@sina.com。

【中图分类号】R33【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.009

Preventive effects of Huanglian Jiedu Decoction on

alcoholic fatty liver in mice

WANG Rui-lin1，LI Xiao-juan2，BAI Yun-feng1，WANG Li-fu1，LI Bei2，LI Yong-gang1，LI Rui-sheng2

(1. Liver Disease Center for Combined TCM and Western Medicine，

2. Research and Technology Service Center，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China)

Abstract【】ObjectiveTo study the preventive effect of a Chinese traditional medicine, Huanglian Jiedu Decoction (HLJDT), on alcoholic fatty liver in mice, and provide experimental evidence for clinical prevention and treatment of alcoholic liver disease. Methods Sixty healthy SPF male C57 mice were randomly divided into control group, model group and low, medium and high dose HLJDT(0.61, 1.22, 2.44 g/kg/d)groups, 12 mice in each group. The mice of model groups were given gastric gavage of 50% ethanol, combined with concomitant HLJDT intervention for 6 weeks. The mice of control group received the same volume of saline. The body weight, liver index, serum biochemical indexes were determined and histopathological changes in the liver and colon tissues were examined and analyzed at 6 weeks after the experiment. ResultsBody weight gains of the mice in all the three dose HLJDT groups were significantly higher than that of the control group (P<0.05)，liver index and the serum ALT, AST and TG contents were significantly decreased (P<0.05 for all). Histological changes in the liver of all the three dose HLJDT groups were significantly milder than those of the model control group, and also improving of the colon mucosal alterations was observed in the three dose HLJDT groups in a dose-dependent manner. ConclusionsHuanglian Jiedu Decoction can well reduce the permeability of intestinal mucosa, and exerts certain preventive and protective effects on alcoholic liver injury in mice.

【Key words】Huanglian Jiedu decoction; Alcoholic fatty liver; Mice

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是一种进行性发展且后期会严重危害身体健康甚至威胁生命的消化系统疾病。其致病因素单一而明确，主要是长期大量饮酒所造成的，但其发病机制却十分复杂[1]。近年来酒精致肠粘膜通透性增加，肠道内毒素渗漏入血及其激活肝Kupffer细胞产生炎症细胞因子机制，是酒精性肝损伤机理研究的热点之一[2,3]。而黄连解毒汤(HLJDT)是由黄连、黄柏、黄芩、桅子四味药组成的清热解毒的代表方，具有泻火解毒之功效，主治实热火毒，三焦热盛之证[4]。目前国内研究证实黄连解毒汤具有抗内毒素、抗肝损伤、抗炎、抗氧化及降血脂等生物活性的作用[5]，但将黄连解毒汤用于干预小鼠酒精性肝损伤的研究国内外还尚未见报道。因此本实验通过黄连解毒汤对酒精性肝损伤小鼠体质量、肝指数、生化指标以及肝脏和结肠组织病理学结果的影响，来探讨黄连解毒汤对酒精性肝损伤的干预作用，以期为酒精性肝病的预防和临床治疗提供新的思路。

1材料和方法

1.1实验动物

选择SPF级C57小鼠，60只，雄性，单鼠体质量为(20～22)g，购自军事医学科学院实验动物中心，生产许可证【SCXK(军)2012-0004】。在302医院SPF级动物实验室内完成，其使用许可证【SYXK(军)2012-0010】。

1.2实验试剂

乙醇(分析纯，纯度>99.7%)(国药集团化学试剂有限公司，批号：20130315)；生理盐水(解放军第302医院制剂室提供，批号：130527405，石家庄四药有限公司)；黄连解毒汤颗粒由解放军302医院药剂室制备。

1.3实验分组与灌胃剂量

60只C57小鼠，随机分为空白对照组、模型对照组、黄连解毒汤颗粒高剂量组(2.44 g/Kg)、中剂量组(1.22 g/kg)、低剂量组(0.61 g/kg)等五组，每组各12只。黄连解毒汤的剂量根据人临床剂量换算，换算公式：小鼠剂量(g/kg)=9.1 × 人临床剂量(0.067 g/kg)。此剂量作为低剂量，中剂量与高剂量分别为低剂量的2倍和4倍。每日不同剂量模型组灌服不同剂量的黄连解毒汤，对照组采用相同剂量的生理盐水灌胃，30 min后[6]，空白对照组灌服生理盐水，其他组灌服50%乙醇，剂量为12 mL/kg，连续灌服6周[7]。且根据每周体重的变化来调整黄连解毒汤和乙醇的灌胃量。

1.4检测指标及方法

每天观察各实验组小鼠的活动情况，采血前禁食12 h后，经小鼠眶后静脉丛采血，离心后取血清检测各组小鼠的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)和甘油三酯(TG) 等三个生化指标。然后再迅速取各组小鼠的肝脏组织，称重，并计算其肝指数=肝质量(g)/体质量(g) × 100%；同时再采集所有小鼠同一部位的肝组织和一段结肠组织，用4%的甲醛固定，HE染色后，分析各组小鼠肝脏和结肠组织的病理学检测结果。

1.5统计学方法

利用SPSS 17.0软件的方差分析方法对各组小鼠的检测指标进行统计学分析，以P<0.05为差异显著性。

2结果

2.1各组小鼠体重增长量、肝指数及生化指标的分析

通过对各组小鼠体重增长量、肝指数和生化指标的对比分析显示：与空白对照组相比，模型组小鼠的体重增长量显著降低(P<0.05)，肝指数显著增加(P<0.05)，血清ALT、AST和TG也显著增高(P<0.05)；而与模型对照组相比，HLJDT各剂量组小鼠的体重增长量均显著增加(P<0.05)，肝指数明显降低(P<0.05)，血清ALT、AST和TG含量明显降低(P<0.05)，其中HLJDT对ALT和TG含量的影响呈现出剂量依赖性(表1)。

表1　各组小鼠体重增长量、肝指数和生化指标分析

注：与空白对照组相比*P<0.05；与模型对照组相比△P<0.05。

Note.*P<0.05, compared with the control group；△P<0.05, compared with the model group.

2.2各组小鼠肝脏病理学分析

空白对照组小鼠的肝小叶结构清晰，肝索排列规则且以中心静脉放射排列，汇管区未见炎症细胞浸润。模型对照组小鼠肝小叶界限模糊，肝细胞内有成堆的脂肪滴，呈典型的酒精性脂肪病变。而灌服黄连解毒汤各剂量模型组小鼠的脂肪变和肝细胞肿胀程度均比模型对照组明显减轻，各剂量组小鼠肝细胞均观察不到成堆的脂肪滴出现，肝小叶及汇管区未见炎性细胞浸润(图1，见文后彩插8)。

2.3各组小鼠结肠病理学分析

结肠病理学结果显示：空白对照组小鼠结肠粘膜层次清晰，表面光滑、整齐，粘膜上皮和腺体结构完整，上皮细胞与固有层间紧密连结；模型对照组小鼠结肠粘膜上皮细胞脱落，上皮细胞与固有层间距显著增宽，腺体结构破坏，隐窝变浅，粘膜下层水肿；而灌服黄连解毒汤模型组从低剂量到高剂量，其肠粘膜层次较模型对照组清晰，上皮细胞与固有层间距从疏散变为紧密连结，结肠粘膜层次渐变清晰，且表面渐变整齐光滑(图2，见文后彩插8)。

3讨论

酒精性肝病的发生是一个复杂的病理生理过程，涉及多种细胞(中性粒细胞、上皮细胞和Kupffer细胞等)和多种有害因子(内毒素、氧化应激和细胞因子等)[8]。众所周知，内毒素(LPS)是肠道革兰阴性杆菌细胞壁的脂多糖，具有高度的免疫活性并能诱导大量炎性介质产生[9]。研究发现乙醇可导致肠道血管通透性增加，使内毒素肠渗漏入血，转运至肝脏与Kupffer细胞相互作用，激活细胞内的多种细胞因子从而引起肝细胞凋亡[10]。因此内毒素血症和内毒素介导的肝细胞损害在酒精性肝病的发病机理中发挥了关键性作用[11]。聂娇等[12]也发现在小鼠酒精性肝病造模过程中肠粘膜通透性增加，从而加剧了肝脏的损伤程度。而方志红等[13]研究发现健脾理气活血方在大鼠体内能够通过降低肠粘膜通透性，从而影响内毒素渗漏而对酒精性肝损伤发挥干预作用。而国内尚未见有关黄连解毒汤是否能够通过抑制肠粘膜通透性而发挥抗内毒素作用，从而对酒精性肝病发挥干预作用的报道。

因此本实验应用黄连解毒汤对酒精中毒小鼠干预6周观察其抗酒精性肝损伤的作用，各组小鼠体重增长量和肝指数以及生化指标结果显示：黄连解毒汤各剂量组结果与模型对照组相比，小鼠体重增长量显著增加(P<0.05)，肝指数显著降低(P<0.05)，血清ALT、AST和TG含量均显著降低(P<0.05)，说明了黄连解毒汤能够显著改善酒精中毒小鼠的食欲，增强肠道营养吸收功能，能够显著降低血清转氨酶的浓度，具有较强的修复酒精性肝脏损伤的效应；同时黄连解毒汤各组能够显著降低血清TG的含量，此结果与其具有抗血脂的结果相一致[14]。而肝脏病理学检查是判断肝脏损伤的金标准[15]，本实验肝脏病理学结果显示三种剂量的黄连解毒汤对酒精性肝损伤均具有显著地改善作用，但不具有显著的剂量依从性，与生化指标的剂量依从性不具有一致性，可能是由于肝脏病理改变与生化指标变化的灵敏度不同造成的。由于肠道革兰氏阴性杆菌多存在于大肠部位，因此本实验选择观察结肠通透性的病理学改变，结肠病理学结果显示模型对照组小鼠结肠粘膜上皮细胞与固有层间距增宽，腺体结构破坏，说明了酒精进入体内蓄积可诱发肠粘膜的损伤，而黄连解毒汤从低剂量到高剂量对肠粘膜具有递增的改善和保护作用，可推断黄连解毒汤通过降低肠粘膜的通透性而影响了内毒素的吸收，对酒精性肝损伤出现的脂肪变性具有抑制和减缓发展的作用，从而发挥抗酒精性肝损伤的效应，而血清内毒素的测定以及黄连解毒汤对酒精性脂肪肝的其它作用机制还有待进一步深入研究和证实。

综上所述，本实验初步验证了黄连解毒汤可显著通过降低肠粘膜通透性从而可能会影响内毒素的吸收，对小鼠酒精性肝损伤具有一定的预防保护作用，为今后深入研究黄连解毒汤及其有效成分的药理学作用，以及在临床上治疗ALD疾病具有十分重要的意义。

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〔修回日期〕2014-12-09