以特异性引物延伸为基础的非综合征唇腭裂易感基因芯片技术

胥　威　　卢永平　　韩维田▲　　宋方田.辽宁省计划生育科学研究院　辽宁省生殖健康重点实验室，辽宁沈阳　003；.辽河油田总医院妇婴医院，辽宁盘锦　400



以特异性引物延伸为基础的非综合征唇腭裂易感基因芯片技术

胥威1卢永平1韩维田1▲宋方田2
1.辽宁省计划生育科学研究院辽宁省生殖健康重点实验室，辽宁沈阳110031；2.辽河油田总医院妇婴医院，辽宁盘锦124010

[摘要]目的设计一种适合检测非综合征唇腭裂（NSCL/P）相关大量单核苷酸多态性（SNP）的基因芯片。方法直接测序法验证基因芯片的准确性，重复检测部分样品验证基因芯片的重复性。结果本研究设计了一种以特异性引物延伸为基础的，适合检测NSCL/P大量相关SNP的，快速、有效、方便、经济、高通量的基因芯片。结论这种基因芯片为临床NSCL/P基因诊断提供一种新型的、灵敏度高、操作简单的技术手段。

[关键词]基因芯片；特异性引物延伸；非综合征唇腭裂；单核苷酸多态性

NSCL/P相关SNP的检测方法很多，包括限制性内切酶酶切法、质谱、直接测序、SNPshot等[1]。这些方法仅适合检测少量SNP，成百上千的SNP检测就比较困难。而NSCL/P的发病与大量SNP密切相关。本研究设计了一种适合检测NSCL/P相关SNP的且快速、方便、有效、经济、高通量的基因芯片。

1　材料与方法

1.1材料来源

选择2010年7月～2012年7月间经中国医科大学附属口腔医院医师确诊的NSCL/P患者50例（男27例，女23例，年龄1～35岁，平均9.96岁），均签署了知情同意书。

1.2仪器及试剂

点样仪（Nano-Plotter 2.1，GeSiM），GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪（Axon Instruments）；芯片探针和特异性延伸引物及阳性对照（南京生物科技有限公司）见表1。多重PCR试剂盒（Takara），血液基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN），EXOI及碱性磷酸酶（Takara），VentR（exo-）DNA聚合酶（NEB）。

1.3方法

1.3.1芯片制备24条探针选于www.genome.wi.mit.edu.。30 μM探针溶解在0.3 M碳酸盐缓冲液。60％相对湿度，点样仪点样在醛基修饰玻片上。

1.3.2特异性延伸引物的设计特异性延伸引物由3’端位于SNP及其上游序列和5’端位于探针互补序列两部分构成。每个SNP设计两条特异性延伸引物与之相匹配。

1.3.3DNA提取20 μL蛋白酶K消化200 μL抗凝血，加入200 μL缓冲液GB，70℃10 min；再加入200 μL无水乙醇充分混匀；吸附柱收集絮状沉淀；再加500 μL缓冲液GD离心，倒掉废液；600 μL漂洗液PW漂洗；最后50 μL洗脱缓冲液洗脱DNA。

1.3.4多重PCR扩增及纯化体系20 μL（10 μL mix2，0.2 μL mix1，0.2μM引物，50 ng DNA）。反应条件94℃10 min；94℃30 s，57℃90 s，72℃90 s，35个循环；最后72℃10 min。多重PCR产物中加入10 μL mix（1.2 U EXOI，0.4 U碱性磷酸酶）纯化，条件：37℃30 min，95℃10 min。

1.3.5特异性引物延伸体系15 μL[纯化后产物5 μL，dATP、dTTP、dGTP和Cy3dCTP各0.375 μL，VentR（exo-）DNA聚合酶0.02U，特异性引物0.025 μM]。反应条件94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，35个循环；最后72℃3 min。

1.3.6杂交10 μL延伸产物加入10 μL杂交液MIX （1.33×SSC，0.067％SSC，0.033 mg/mL鲑鱼精和50 nMCy3标记阳性对照）同芯片杂交，60℃杂交2 h。

1.3.7芯片扫描及检测分析共聚焦激光扫描仪扫描芯片。基因型通过计算每个SNP的等位基因分数（AF）读取，AF=等位基因B/（等位基因A+等位基因B）。AF＜0.4，0.4≤AF≤0.6及AF＞0.6基因型分别为AA，AB及BB。

1.3.8直接测序随机挑选10％样本测序，验证芯片检测结果。

表1　SNP位点的探针及特异性延伸引物

2　结果

2.1芯片设计

查阅NSCL/P易感基因相关的文章，挑选研究较多的SNP，进行Meta分析（具体检索中国生物医学文献数据库、中国学术期刊全文数据库和PUBMED获得全部相关的中英文文献，汇总全部文献中的结果进行分析）。选取与NSCL/P密切相关的SNP（表1），其相应探针阵列见封三图5A。

2.2芯片检测结果

封三图5B可见SNP检测结果：rs11466285TC， rs2235371CT和rs3917201GA，其他SNP均为常见基因型。

2.3准确性与重复性

芯片检测50例样本，检出率为100％。另外，芯片的检测结果与直接测序的结果完全一致，准确性（两种方法检测结果一致的样本数/10％样本总数）亦为100％。随机选取25个样本，芯片检测3次，其结果均一致，重复率（3次芯片检测结果一致样本数/25例）为100％。

3　讨论

NSCL/P是不伴发其他系统畸形的、不属任何综合征的唇裂、唇裂合并腭裂的总称，是一种常见的先天性颜面部缺陷[2-5]。世界各地发病率为1/2500～1/500，不同种族和地域发病率有很大差异，其中亚洲黄种人最高，欧洲白种人次之，非洲黑种人最低[6，8]。病因研究认为NSCL/P是环境因素和遗传因素相互作用的结果。遗传学认为NSCL/P是一种多基因相关的遗传病。目前，大量NSCL/P发病密切相关候选基因（包括MTHFR、TGFA、TGFB3、RARA、MSX1、IRF6及RFC1等）及其SNP已被确定[9-12]。本研究查阅以往大量文献，收集相关数据，通过Meta分析，挑选出有意义的且与NSCL/P发病相关的SNP作为检查对象，来设计基因芯片阵列。

基因芯片是人类基因组计划带来的最有应用价值的科研成果，融合了生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生命信息学等多种学科的最新技术。寡核苷酸芯片技术是目前SNP检测中最有前景的一种方法，在芯片几平方毫米的面积上可以固定几百个检测探针，具有高通量的特点，同时它的点样、标记、检测等的自动化过程高，为准确、高效、低廉的SNP检测奠定了基础[13-15]。本研究采用的这种寡核苷酸芯片针对NSCL/P相关7个易感基因的12个SNP位点进行检测，该方法信息量大、效率高、速度快。本研究采用的以特异性引物延伸为基础的基因芯片，只需要一种单色荧光系统，而且荧光信号较强，费用较低，同时简化了数据分析。

本研究中，基因芯片检测50例NSCL/P样本，检出率为100％。随机选取样本的测序结果与基因芯片结果完全一致，说明该芯片检测结果准确可靠。因此，该芯片是一种适合NSCL/P相关SNP检测的且快速、有效、经济、高通量的方法，为临床NSCL/P易感基因检测提供了一个新的技术平台。未来我们将在该基因芯片的基础上添加更多的NSCL/P相关SNP，以满足将来临床基因诊断需要。

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Gene microarray based on allele-specific primer extension for NSCL/P

XU Wei1LU Yongping1HAN Weitian1SONG Fangtian2
1.Liaoning Provincial Research Institute of Family Planning, Liaoning Provincial Key Laboratory of Reproductive Health, Shenyang 110031, China; 2.Liaohe Oilfield General Hospital, Panjin 124010, China

[Abstract]Objective To design gene microarray suitable for genotyping extensive SNPs involved in NSCL/P. Methods Direct sequencing was used to ensure the accuracy of gene microarray results. In order to ensure the repeatability of gene microarray results, some samples were tested three times. Results In this study, we designed an efficient, rapid, convenient, highly parallel, and inexpensive gene microarray that is based on allele-specific primer extension and suitable for genotyping SNPs involved in NSCL/P. Conclusion It is a new, sensitive, simple method for NSCL/P gene diagnosis in clinic.

[Key words]Gene microarray; Allele-specific primer extension; NSCL/P; SNP

收稿日期：（2015-10-29）

[基金项目]辽宁省科技攻关项目（2009225007-7）▲通讯作者

[中图分类号]R782.2

[文献标识码]B

[文章编号]1673-9701（2016）02-0076-03