生物修复石油污染土壤研究进展

詹亚斌，马立安

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)



生物修复石油污染土壤研究进展

詹亚斌，马立安

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

石油作为一种重要的能源，在被大量开采、运输和使用的同时，带来了严重的污染。利用微生物修复与降解石油烃类污染物成为当前治理石油污染最为理想的有效方法。介绍了营养成分、接种量、pH、石油含量、温度、培养转数等对降解过程的影响以及微生物在修复石油污染土壤中的应用研究进展。

石油污染；石油降解菌；微生物修复

石油作为现代工业的命脉，已被全世界广泛使用。石油在开采、运输、加工、储存过程中不可避免地会发生石油泄露事故，造成土壤及水体的严重污染[1]。石油进入土壤之后，会破坏土壤结构，影响土壤通透性，改变土壤理化性质。石油若是进入到地下水，就会污染地下水源，影响生活、生产用水，从而危害人类的健康。同时，石油中的可溶性成分溶解到水中会形成持久性污染，增加了修复的难度[2,3]。石油污染情况日益严重，世界各国的科研工作者都十分重视石油污染土壤的修复技术研究，各国纷纷制定土壤修复计划[4]。

生物修复(主要指微生物修复)是一种新兴清洁技术，与物理、化学修复污染土壤技术相比，它具有成本低、不破坏生长所需要的土壤环境、操作简单、处理效果好、无二次污染等特点，越来越引起人们的关注。早在1989年，美国阿拉斯加海域受到大面积石油污染后，首次大规模应用生物修复技术，这是生物修复技术发展的里程碑[5]。国内的研究起步较晚，到20世纪90年代，才有油区开展石油污染土壤修复技术研究[6]。

生物修复技术是在生物降解的基础上发展起来的，可以通过环境因素的最优化而加速自然生物降解速率。生物修复技术被划分为原位生物修复(投菌法、生物培养法、生物通气法及地耕处理等)[7]和异位生物修复(预制床法、厌氧处理法、堆肥法及生物反应器等)[8]2种。原位生物修复费用较低，但较难控制。Misshra等[9]采用投加微生物加营养物质的原位生物修复技术对4000m2的石油污染土壤进行修复，结果证明是可行的。陈立等[10]采用原位生物修复技术修复陕北石油开采区的石油污染土壤，证明该修复技术在陕北黄土区石油污染土壤修复的有效性。原位生物修复方法难以满足要求时，异位生物修复技术就成为一个重要的选择。将污染土壤移离原地放入池子，投加菌种、营养物，还可以调节pH或者加入碎秸秆、麸皮增加污染物中的空隙，这样有利于微生物对污染物的降解。张红岩等[11]利用自行设计生物堆肥设备对废弃油基钻井泥浆进行为期90d的生物堆肥试验。研究发现“废弃油基钻井泥浆+锯末+营养物+微生物”堆肥方案的处理效果最佳，石油类降解率高达87.0%。

1 石油降解菌的筛选与分离

土壤中存在着大量的能够利用有机物的微生物，主要有细菌、真菌、放线菌等，它们具有氧化分解有机物的能力。在许多条件下，降解菌驯化时间长、生长速度慢、代谢活性不高，并且很不稳定，因此筛选一些稳定高效降解污染物的菌种，是生物修复的必然要求。

石油组成成分十分复杂，目前已分析出大约 600 种烃类，还有数千种组分无法辨认[12]，单一微生物不可能完全完成石油的降解过程，必须通过多种不同功能的微生物共同作用，构建复合菌群，才能尽可能地实现石油污染物的完全降解。不同菌株之间往往存在协同与拮抗作用，在构建复合菌群时，必须考虑菌株之间的相互关系。将降解不同组分的菌株复配在一起，提高菌群对石油降解的效率。李宝明等[13]从胜利油田井、炼油厂附近以及炼油厂排污口采集石油污染土壤，筛选得到236株能在以石油作为唯一碳源的培养基中生长的石油降解菌株，在构建菌群时发现，用4株单菌构建的菌群降解效果最好，5d内石油降解率可以达到55.5%，比单一菌株在相同条件下降解率提高了15.5%。

2 影响微生物降解石油的因素

总石油烃(TPH)的微生物降解是一个极其复杂的过程，其降解效率不仅仅取决于微生物的群落和组成，还与TPH存在的数量和状态、周围环境等众多因素有关。在筛选过程中，有许多因素会影响微生物对石油的降解率。其中主要包括营养成分、接种量、pH、温度、石油含量、培养转速等。土壤的结构、母质、含水率也对微生物的降解率有很大的影响，可以适当地添加营养物质，例如添加桔梗木屑扩大土壤孔隙度，添加适量水分保障微生物快速生长繁殖，以便达到好的降解效果[10]。

2.1 营养成分

石油污染土壤中有机碳含量很高，氮磷含量很少。为了达到较好的修复效果，在向石油污染土壤添加氮(N)、磷(P)等营养物时，必须首先确定营养盐的形式、浓度以及适当的比例。选择合适的培养基配方，有利于降解菌筛选、分离和驯化工作的开展。

无机盐构成细胞和酶的组成成分、酶的激活剂以及维持适宜的渗透压，盐分主要通过影响降解微生物的代谢活性来影响石油降解效率。李燕妮[14]在试验中发现高浓度盐分含量对微生物降解石油有很大的抑制作用，即随着盐分含量的增加，微生物对石油的降解性能逐渐下降。

同一油田中筛选的石油降解菌，其耐盐度也是有所差异的。张帆[15]筛选了5株菌，在研究中发现1株菌的最适盐浓度为0，3株菌的最适盐浓度为0.5%，还有一株菌的最适盐浓度为1%。在高于或者低于最佳盐度时，各菌株的生物量和降解率都明显降低。

有些石油污染土壤含盐量较高，为此，必须筛选高效耐盐石油降解菌。吴涛[16]从黄河三角洲盐渍化石油污染土壤中分离出2株高效耐盐石油降解菌，经鉴定为恶臭假单胞菌和沙雷氏菌，耐盐范围分别为0.5%～6.0%和0.5%～7.0%。

不同的微生物其最适氮源是不一样的。张帆[15]筛选了5株菌，在研究中发现，当氮源分别为KNO3、NaNO3和NH4Cl时，菌株的石油降解率都不相同。也有微生物能适应多种氮源，马强[17]筛选了2株菌能够利用NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3等氮源，降解效率都在70%以上。筛选所得的石油烃降解菌能够利用K2HPO4和KH2PO4为磷源，降解效果比单独应用K2HPO4或KH2PO4要好一些，主要可能是由于K2HPO4/KH2PO4(1∶1)体系对降解过程中选择性培养液的pH能起到很好的缓冲作用，从而为降解菌提供了一个稳定的降解环境。

2.2 接种量

接种量主要通过影响微生物的调整期来影响生物对石油的降解率。接种量小时，微生物调整周期长，降解速率慢；接种量大时，微生物调整周期较短，降解速率快；但是接种量也不宜太大，李燕妮[14]发现当接种量低于或高于7%，菌群对石油的降解作用均不同程度地降低。其原因主要是，当接种量较低时，由于微生物不能快速而又充分的利用摇瓶中的碳源，表现为石油降解率的降低，且当接种量较大，由于微生物数量较大，对营养物质的需求增大，使得摇瓶中的营养物质相对供应不足，不能使微生物的数量进一步增长，从而使得石油降解率降低。

有些微生物的石油降解率决定因素并不是接种量，谢云[18]在研究中发现，当接种1%～10%的菌量，都具有很好的降解率。从经济方面考虑，将最佳接种量定为1%。

2.3 pH

pH是影响生物降解石油烃的重要因素，不同的菌株有各自适宜的pH，pH还能够影响微生物的生物活性，pH过高或者过低都不利于微生物对石油污染物的降解，因此确定菌株降解原油时的最适pH是非常重要的。可以向土壤中添加适量的酸碱缓冲液调控土壤的pH，由此达到微生物高效降解石油的目的。

大多数石油降解菌适合在pH为7.0的环境中生存，张帆[15]、马强[17]、徐冯楠[19]在研究中发现pH为7时，菌株的生物量最大，降解率也最高。一些菌株适合在中性偏酸的环境中生存，谢云[18]筛选得到2株菌，降解率在pH 6～7之间达到最高为60%以上。部分菌适合在偏碱性的环境中生存，阮志勇[20]研究发现，当pH为8时，反应体系中微生物的活菌量达到一个较高值，此时石油的去除率也达到最高值。李燕妮[14]也筛选了1株适宜生存在中性偏碱性pH为9的环境中的石油降解菌，石油降解率最高为39.98%。

2.4 石油含量

石油浓度对微生物降解有很大的影响，低浓度石油通常不会对普通微生物产生毒害，还可以刺激嗜油微生物的生长。石油浓度过高会抑制微生物活性，对微生物有毒害作用[10]。

徐冯楠[19]研究发现石油的降解率与初始浓度成反比的关系。高浓度石油会影响营养和氧的传递，从而影响微生物的活性。研究中发现，石油浓度越大，油滴残留的越多。这可能是石油组分中某些微生物对挥发性的烃类抗毒性作用小，这些挥发性烃类是优良的类脂质溶剂，它们能破坏细胞膜与细胞壁的类脂质，从而抑制了微生物的降解。另外，当石油浓度过大时，培养液中空气的通透性变差，溶解氧减少，好养菌不能良好地生长，致使降解率下降。

2.5 温度

温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构和功能以及细胞结构来影响生物生长、繁殖和新陈代谢。徐冯楠[19]和阮志勇[20]通过测定菌液D600nm值和原油降解率，以确定菌株降解石油最适温度。结果显示，高温和低温都不利于菌株生长以及对石油的降解。

我国北方某些油田在开采过程中污染了土壤，此时就需要耐低温石油降解菌来降解土壤中的石油。赵全[21]从曝气池污泥中分离、筛选得到在低温条件下能以石油烃类物质为唯一碳源、能源的且具有良好降解性能的耐低温琼式不动杆菌。

2.6 培养转数

培养转数可以间接反映通气量，不同类型的微生物对氧的需求是不同的。培养转数对菌株的生长和石油降解有一定影响，活菌量和石油降解率随着转速升高而升高，但是到达一定的转速，活菌量和石油降解率维持不变。

培养转数也不是越高越好，谢云[18]在研究中发现，当培养转数较小时，石油烃培养基中的溶解氧含量较少，不能支持细菌的生长，细菌生长受到一定的抑制；当培养转数高于200r/min时，培养转数过快导致菌体细胞受到损伤，降解菌的降解酶合成和代谢受到抑制，从而影响到降解菌的原油降解率。

3 微生物降解石油污染土壤的研究进展

筛选石油降解菌后，将其投入石油污染土壤中去，研究微生物对污染土壤中石油的降解效率。孙先锋等[22]利用生物刺激和生物强化2种方法进行油污土壤生物修复，将筛选得到的枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌投入到长庆油田污染土壤中，经过60d修复试验，发现生物刺激在降解饱和烃、降低土壤中溶液表面张力、增加微生物数量、提高土壤酶活性方面优于生物强化，而生物强化则对于石油烃中难降解的芳香烃有很好的降解效果，两者各有优势。土著微生物也可以降解石油，但是没有外加菌剂降解效果好。闫毓霞等[23]利用微生物修复胜利油田含油污泥，使用外加菌剂比利用土著微生物的石油降解率高6.5%。在降解过程中，应根据菌种特性适当添加营养元素。杨茜等[24]将分离筛选的石油降解菌(不动杆菌)接入陕北某油井周围石油污染土壤，并添加氮磷营养，进行为期8周的生物修复处理，修复期间每天均匀翻动土壤保持透气性，石油降解率达到57.5%。向油污土壤中投加降解菌可以显著提高土壤细菌群落的多样性。细菌群落多样性结构越复杂，对石油烃的降解效果相对较好。也可以改良土壤的孔隙度，以便微生物能更好地降解污染土壤中的石油。齐建超等[25]将胜利油田表层0～20cm石油污染土壤，自然风干，过100目筛备用，经过改良，按照4%的比例加入混合菌剂，石油烃降解率可达到73%，土壤微生物数量增加，多样性更为丰富。石油组分复杂，单一菌种降解效果不是很理想，这时候可以考虑构建菌群降解污染土壤中的石油。陈立等[26]从陕北某油田的石油污染土壤筛选石油降解单菌，将其组成菌群。对这些菌群进行放大培养，进行石油污染土壤修复试验研究，2个试验区土壤中人为添加石油质量分别为1542 mg·kg-1和1886mg·kg-1时，经过11～32d的原位修复，土壤中石油累计降解率可达69.52%～88.11%，而对照区土壤中人为添加的石油含量变化不大，去除率在20%左右，研究表明，混合菌群降解石油效率高。

4 展望

石油污染土壤的普遍性、危害性在我国已经逐渐引起社会的广泛关注。我国对石油依赖度逐渐增高，土壤也面临着更大的污染风险。

针对受石油中轻度污染的农业土壤，需要着力发展能大面积应用的、廉价的、环境友好的生物修复技术和物化稳定技术，实现边修复边生产，以保证生态环境安全[27]。筛选出合适的降解菌后，还要提供其适宜的生存环境，以满足微生物的生长需求，同时土壤的结构、孔隙度及含水率也对微生物的降解效率有很大的影响。在实际降解过程中，要综合考虑这些因素。

微生物技术处理效果好，费用低，最终产物是CO2、H2O等物质，不产生二次污染，但作为一种新型技术在推广使用时还面临许多难题。例如：石油类污染物水溶性差，不利于微生物对其降解；微生物生长缓慢，修复周期长；很难彻底降解石油污染物；污染物浓度过高时对微生物具有很大的毒害作用等。因此，高效、稳定、适应性强、广谱性的“土著”菌株的筛选与分离以及混合菌群的构建仍是今后研究的重点。

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2016-08-26

詹亚斌 (1991-)，男，硕士生，研究方向为环境微生物。通信作者：马立安， malian@yangtzeu.edu.cn。

X53;X172

A

1673-1409(2016)33-0052-05

[引著格式]詹亚斌，马立安.生物修复石油污染土壤研究进展[J].长江大学学报(自科版)，2016，13(33)：52～56.