多发性骨髓瘤患者骨髓组织中NF- κB/p65的表达与硼替佐米疗效的关系

林桐，张启国，吴鸿雁，张李玉，董海波，欧阳建

(1.南京医科大学鼓楼临床医学院 血液科，江苏 南京　210009；

2.南京医科大学鼓楼临床医学院 病理科，江苏 南京　210009)



多发性骨髓瘤患者骨髓组织中NF-κB/p65的表达与硼替佐米疗效的关系

林桐1，张启国1，吴鸿雁2，张李玉1，董海波1，欧阳建1

(1.南京医科大学鼓楼临床医学院 血液科，江苏 南京210009；

2.南京医科大学鼓楼临床医学院 病理科，江苏 南京210009)

[摘要]目的: 观察NF- κB/p65在初发的多发性骨髓瘤(multiple myeloma， MM)骨髓活检组织中的表达与患者临床特征及硼替佐米疗效的关系。方法: 应用改良的甲基丙烯酸甲基酯单体塑料包埋法进行骨髓活检组织制片，采用免疫组化法分别检测59例初诊MM和10例正常对照骨髓活检组织中NF- κB/p65的表达情况，并分析NF- κB/p65与MM患者临床特征及疗效的关系。结果:(1) 59例MM患者中40.67%(24/59)NF- κB/p65高表达，对照组10例均为低表达，两组差异有统计学意义(P<0.05)。(2)在NF- κB/p65高表达患者中，含硼替佐米方案与不含硼替佐米方案疗效差异有统计学意义(88.9% vs 26.7%， P=0.02)；但在NF- κB/p65低表达患者中，含硼替佐米方案与不含硼替佐米方案疗效差异无统计学意义(50% vs 23.8%， P=0.11)。结论: NF- κB/p65在MM骨髓组织中表达水平明显升高，NF- κB/p65高表达的MM患者使用含硼替佐米的方案疗效优于未含硼替佐米治疗者，MM患者骨髓组织NF- κB/p65表达水平可能成为预测硼替佐米治疗MM疗效的依据之一。

[关键词]多发性骨髓瘤； NF- κB/p65； 免疫组织化学； 硼替佐米

多发性骨髓瘤(multiple myeloma， MM)是以骨髓中单克隆浆细胞恶性增殖和异常积聚为特征的肿瘤，迄今仍认为是不可治愈的疾病，中位生存期为3~4年[1- 2]。使用传统细胞毒药物化疗患者获益不多，故深入研究MM发病机制中起关键作用的因子，以便针对性地进行药物干预以提高临床疗效具有重大意义。目前已有硼替佐米等数种新药用于临床，疗效有了很大提高。

NF-κB家族成员(p50/105， p52/100， p65/RelA， RelB， c- Rel)均相互形成二聚体来参与NF-κB依赖的转录活动。NF-κB通路可由细胞因子、趋化因子、生长因子、黏附分子、抗原受体、环境压力和其他等激活。激活途径有经典通路和非经典通路两种，经典通路通常主要依赖于NF-κB抑制物激酶γ(IKKγ)调节的NF-κB抑制物激酶β(IKKβ)所激活的，主要由p50/p65二聚体参与，通常经典通路较为多见。大量与肿瘤发生进展相关的基因研究[3]突出了NF-κB通路激活在MM发病机制中的重要性，为通过抑制NF-κB通路激活来治疗MM提供合理发展基础[4- 5]。本研究通过观察MM患者骨髓活检组织中NF-κB/p65的表达情况分析其与各临床变量的关系以及硼替佐米对NF-κB/p65高表达MM患者治疗有效率的影响。

1资料与方法

1.1病例资料

选择南京鼓楼医院血液科2012年1月至2014年12月初诊为MM的患者59例，所有患者均符合WHO 2008年MM诊断标准。临床分期分别采用DS分期及ISS分期，中位年龄为60(33~80)岁，男27例，女32例。参照ISS分期标准，36例(62%)在诊断时处于Ⅲ期，16例(27%)处于Ⅱ期，7例(11%)处于Ⅰ期；参照D- S分期标准，49例(84%)在诊断时处于Ⅲ期，5例(8%)处于Ⅱ期，5例(8%)处于Ⅰ期；25例(43%)为IgG型，15例(25%)为IgA型，6例(10%)为IgD型，13例(22%)为轻链型；中位β2- 微球蛋白水平6466(1218~20000)μg·ml-1；肌酐水平正常(<133μmol·L-1)45例,占77%，高于正常(≥133μmol·L-1)14例,占23%；中位浆细胞比例21.9%(0.5%~90%)；FISH(荧光原位杂交)中，45例患者中发现19例存在1q扩增，16例存在13q缺失；41例患者中发现10例p53缺失。23例患者予以含硼替佐米方案治疗，包括PD、PTD、PTCD方案，其余36例患者予传统药物方案治疗，包括VAD、CTD、VADT以及马达兰+泼尼松方案。

参照IMWG制定MM疗效标准[6]，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)。平均4个疗程后评估疗效，CR+PR为治疗有效组，未达PR为治疗无效组。

对照组10例，其中健康造血干细胞捐赠者6例，淋巴瘤Ⅰ期患者4例，其骨髓细胞形态、病理及外周血象检查均正常，中位年龄为42(24~52)岁。

1.2方法

1.2.1标本制备应用我科研制的甲基丙烯酸甲基酯单体为主的包埋试剂盒NJ- Resin2011。配置A液成分(改良的MMA单体)：MMA单体100ml+过氧苯甲酰150mg+聚乙二醇(PEG400)12.5ml。配置B液成分(加速剂)：N，N二甲基苯胺1 ml+聚乙二醇(PEG400)8ml。均于髂后上棘局部麻醉后用B65- 01骨髓活检针，取得活检组织块，大小为2 mm×(8～10) mm。所得标本梯度乙醇脱水，然后放入改良的MMA单体A液中，-20℃过夜。将活检组织块置入1.5ml容量的塑料模具中，加入约1.5ml的改良MMA包埋剂A液，吸取3μl B液加入模具中，迅速将A、B两液搅匀成全包埋液，将活检组织块置于模具底部中央位置，静置于-20℃冰箱中待其聚合。聚合后制备3μm厚的切片，98~100℃热水中展片，切片裱于带电荷的玻片上，置丙酮中2h脱去塑料。

1.2.2免疫组化免疫组化方法为EnVison两步法：一抗NF-κB/p65(货号MAB3026，Millipore公司)，工作浓度为1∶50。免疫组化结果评分：NF-κB/p65阳性细胞的判断及计数，以镜下观察到细胞核棕黄色为阳性细胞，在光镜(×200)下观察整个切片，随机选择5个视野进行计数得出平均阳性百分率。标准如下：阳性细胞数0%为阴性(-)，≤10%为低水平表达(+)，<10%而≤50%为中等水平表达(++)，<50%而≤80%为较高水平表达(+++)，>80%为高表达(++++)。表达水平判断标准：(-)～(+)为NF-κB/p65低表达；(++)～(++++)为NF-κB/p65高表达。所有患者的病理切片由两位病理科医师进行独立阅片。

1.3统计学处理

2结果

2.1NF-κB/p65在不同骨髓活检组织中的表达

59例MM中NF-κB/p65的高表达率为40.67%(24/59)，对照组为0，两组间差异有统计学意义(P<0.05，图1、2)。

A.对照组NF-κB/p65(-)； B.MM组NF-κB/p65(+++)

图1NF-κB/p65在对照组和MM组骨髓活检组织中的表达情况(×200)

Fig 1The expression of NF-κB/p65 in control and MM bone marrow biopsies(×200)

图2对照组与MM组NF-κB/p65的表达情况比较

Fig 2NF-κB/p65 expression of control and MM patients

2.2MM各个临床变量与NF-κB/p65表达结果的关系

MM患者ISS分期Ⅲ期患者高表达率为42.8%，Ⅰ、Ⅱ期高表达率为38.7%，差异无统计学意义(P>0.05)；D- S分期Ⅲ期患者高表达率为42.8%，Ⅰ、Ⅱ期高表达率为30%，差异无统计学意义(P>0.05)，且两组间浆细胞比例差异也无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3硼替佐米对NF-κB/p65高表达MM患者治疗有效率的影响

59例多发性骨髓瘤患者治疗方案不同，在NF-κB/p65高表达患者中，含硼替佐米方案治疗组9例，不含硼替佐米方案治疗组15例，两组治疗有效率分别为88.9%及6.7%，差异有统计学意义(P<0.05)。但在NF-κB/p65低表达患者中，含硼替佐米方案治疗组(n=14)与不含硼替佐米方案治疗组(n=21)治疗有效率差异无统计学意义(50%vs23.8%，P>0.05，图3)。

表1NF-κB/p65的表达及与临床变量的关系(n=59)

Tab 1The relationship between NF-κB/p65 expression and clinicopathologic factors of 59 cases of MM patients

临床特征np65高表达组p65低表达组P值MM592435性别 男2715(62.5%)12(34.3%) 女329(37.5)23(65.7%)0.061年龄 <60岁299(37.5%)20(57.1%) ≥60岁3015(62.5%)15(42.9%)0.138ISS分期 Ⅰ、Ⅱ期3112(50.0%)19(54.3%) Ⅲ期2812(50.0%)16(45.7%)0.746D-S分期 Ⅰ、Ⅱ期103(12.5%)7(20.0%) Ⅲ期4921(87.5%)28(80.0%)0.451M蛋白/g·L-123.22±7.0824.77±4.160.841肌酐/μmol·L-1187.44±43.69118.45±27.470.189血红蛋白/g·L-194.87±6.13104.41±4.980.232β2微球蛋白/μg·ml-17519.8±1617.55881.5±944.60.354浆细胞比例/%21.04±5.0222.55±4.540.827FISH 1q扩增7/1712/280.912 13q缺失8/198/260.433 P53缺失4/1014/310.775

图3中硼替佐米对治疗有效率的影响

Fig 3effects of bortezomib in the treatment efficiency

3讨论

本研究结果显示，59例MM患者骨髓组织中NF-κB/p65高表达者占40.67%，低表达者占42.37%，零表达占16.94%，而对照组均为零表达，两组比较差异有统计学意义。故MM患者骨髓组织中NF-κB/p65存在过表达的现象。原因可能为：(1) NF-κB信号分子突变，Annunziata等[4]系统地研究了突变的NF-κB信号分子，发现82%的MM样本中表达高水平的NF-κB活化信号分子；(2) 作为NF-κB活化抑制剂，与正常人比较，MM患者中多态性的IκB基因发生频率增加，提示MM中NF-κB活化的发生率增加[7]；(3) 能够激活NF-κB通路的受体，如CD28，只在恶性浆细胞表面存在，而正常浆细胞不能表达[8]；(4) 骨髓瘤细胞与基质细胞之间的直接接触导致骨髓瘤细胞中NF-κB通路的激活[9]。NF-κB通路激活的MM细胞有助于通过提高生长、存活、黏附、血管生成和转移从而致病。骨髓基质细胞中NF-κB通路的激活也有利于MM的发病。

本研究发现，很多临床变量在NF-κB/p65表达水平间的差异无统计学意义，如MM各临床分期均有NF-κB/p65高表达，Ⅰ、Ⅱ，Ⅲ期组间未见差异，可能提示NF-κB/p65在MM的发病机制中起了一定的作用。

目前已经发现数种通过阻断NF-κB通路的激活来治疗MM的药物，包括硼替佐米、沙利度胺、雷那度胺和三氧化二砷等[10- 12]。这些NF-κB通路抑制剂作为单药用于骨髓瘤细胞时，其安全剂量可能无法完全抑制其生长，然而，因为它们在一定程度上抑制肿瘤细胞生存，通过处理后的细胞可能对于其他细胞毒性药物的敏感性增强，从而可以适当减少此类药物的剂量，达到协同作用的效果。在MM的治疗中使用NF-κB通路抑制剂，可明显增强传统化疗方案对肿瘤细胞的杀伤作用[13]。

由于IκBα是蛋白酶体的一种基质，硼替佐米用于MM的治疗机制之一为抑制NF-κB通路的激活，通过抑制IκBα的降解阻止p50/p65核易位发挥作用[14]。本研究选取了经典途径特有的家族成员NF-κB/p65，在其高表达患者中，含硼替佐米方案治疗与不含硼替佐米方案治疗缓解率差异有统计学意义(P=0.02)；但在NF-κB/p65低表达患者中，含硼替佐米方案治疗与不含硼替佐米方案治疗短期缓解率差异无统计学意义(P=0.11)。说明对NF-κB/p65高表达的MM患者优先选用含硼替佐米的治疗能取得较好的疗效。但这一结果仍需进一步证实。原因为：(1) 该59例MM患者治疗方案中的药物如沙利度胺，也同样具有阻断NF-κB通路的作用；(2) 硼替佐米除了抑制NF-κB激活以外，也可诱导细胞周期停滞、细胞凋亡、细胞自噬等，这一反应提示含硼替佐米的疗法不一定可以成为高选择性的治疗策略[15]；(3) 虽然经典通路较为多见，但MM中不能排除存在非经典通路激活的可能，且近期有研究指出同时抑制NF-κB的经典通路和非经典通路具有加强抗肿瘤活性、克服肿瘤微环境的增殖和抗凋亡作用[16- 17]；(4) 本研究中收集病例数较少，所得结果仍有片面性。

综上所述，我们的研究结果表明59例MM中NF-κB/p65的高表达者占40.67%，单因素分析发现NF-κB/p65表达水平与临床ISS分期、D- S分期、总疗效等无关，与对照组比较，MM患者NF-κB/p65存在过表达的现象。对NF-κB/p65高表达的MM患者，应优先选用含硼替佐米的治疗方案。但本研究样本量较小，仍需扩大病例数及对NF-κB非经典通路特征性的家族成员进行检测分析，使结果更加完善。

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Expression of NF-κB/p65 associated with the efficacy of bortezomib in multiple myeloma

LIN Tong1，ZHANG Qi- guo1，WU Hong- yan2，ZHANG Li- yu1，DONG Hai- bo1，OUYANG Jian1

(1.DepartmentofHaematology，NanjingDrumTowerHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210009，China;2.DepartmentofPathology，NanjingDrumTowerHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective: To explore NF- κB/p65 expression in the bone marrow of newly diagnosed multiple myeloma (MM) and the relationship between it and the overall response rate after treatment. Methods: The bone marrow sections were made from plastic(methyl- methacrylate)- embedded bone marrow biopsies. The NF- κB/p65 expression of MM group and control group were detected by EnVison immunohistochemistry. The clinical significance of NF- κB/p65 was analyzed. Results: NF- κB/p65 was highly expressed in 40.67%(24/59) MM bone marrow biopsies， expression of all 10 patients in the normal control group were low， there was significant difference between the two groups (P<0.05). In patients of highly NF- κB/p65 expressed，the treatment response rate showed statistically significant difference between groups treated with bortezomib and without bortezomib (88.9% vs 26.7%， P=0.02)， but in patients with low expression of NF- κB/p65， the treatment response rate showed no significant difference in the two groups (50% vs 23.8%， P=0.11). Conclusion: The expression of NF- κB/p65 in MM bone marrow biopsies increases significantly. MM patients with high expression of NF- κB/p65 preferr the clinical benefit of bortezomib- based regimens. NF- κB/p65 expression level may form the basis for predicting the efficacy of bortezomib- based regimens．

[Key words]multiple myeloma; NF- κB/p65; immunohistochemistry; bortezomib

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．009

[中图分类号]R733.3

[文献标识码]A

[文章编号]1671- 6264(2016)01- 0041- 05

[通信作者]欧阳建E- mail:oy626@sina.com

[作者简介]林桐(1989-)，女，江苏靖江人，在读硕士研究生。E- mail:lintong_19890908@163.com

[收稿日期]2015- 07- 14[修回日期] 2015- 09- 22

[引文格式] 林桐，张启国，吴鸿雁，等.多发性骨髓瘤患者骨髓组织中NF-κB/p65的表达与硼替佐米疗效的关系[J].东南大学学报:医学版,2016,35(1)：41- 45.

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