超滤浓缩对小新月菱形藻活性的影响

■于建华　周　玮　王国栋　任绍洁

（1.内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽028042；2.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023；3.大连举扬科技有限公司，辽宁大连116023）



超滤浓缩对小新月菱形藻活性的影响

■于建华1周玮2王国栋3任绍洁1

（1.内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽028042；2.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023；3.大连举扬科技有限公司，辽宁大连116023）

摘要：试验研究了饵料浓缩机在不同操作压力、不同起始密度对小新月菱形藻（Nitzschiaclos⁃teriumf.minutissima）进行浓缩后细胞活性的影响。通过超滤技术，利用单胞藻饵料浓缩机对小新月菱形藻进行浓缩，操作压力为0.10、0.16、0.20 MPa，小新月菱形藻起始密度分别为1.0×106、2.0×106cells/ml，对不同浓缩时间的浓缩藻进行再培养。结果表明，小新月菱形藻起始密度1.0×106、2.0×106cells/ml，采用操作压力分别为0.20 MPa和0.16 MPa时对藻细胞活性影响最小，藻细胞繁殖速度较快，繁殖密度较大。结果提示，饵料浓缩机在合理的压力下可以对不同浓度的新月菱形藻进行浓缩，不影响藻细胞的活性。

关键词：超滤；小新月菱形藻；压力；活性

小新月菱形藻（Nitzschia closteriumf. minutissi⁃ma）隶属于硅藻门、羽纹纲、管壳缝目、菱形藻科，菱形藻属，属于海洋微藻的一种[1]。小新月菱形藻是很多水产经济动物幼体生长发育的优良饵料，同时也是很多饵料生物生长繁殖的最佳饵料[2-5]。目前，微藻的培养、投喂一般与生产育苗同时进行，因而育苗的成败很大程度上取决于是否提供优质、充足的微藻。为了解决饵料供应问题，很多学者采用超滤浓缩技术对单胞藻进行浓缩，获得大量浓缩饵料[6-7]。超滤技术是一种膜分离技术。周玮研究了超滤技术対金藻的浓缩效果，结果表明适宜的操作压力下，浓缩效果明显，对金藻活性不产生影响，且操作简单、清洗方便[7-9]。但是利用单胞藻饵料浓缩机对小新月菱形藻的浓缩方面的研究报道很少，小新月菱形藻如果在浓缩过程中藻细胞遭到破坏，则营养物质损失，失去了应用价值。本试验利用大连海洋大学研制开发的单胞藻饵料浓缩机（MFZ-1）对小新月菱形藻进行浓缩，研究了操作压力和起始密度对小新月菱形藻细胞活性的影响，为生产上进一步合理利用单胞藻饵料浓缩机提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

单胞藻饵料浓缩机(MFZ-1)、显微镜（CX21FS1）、血球计数板（XB-K-25）。

小新月菱形藻由大连陆源海产科技园单胞藻饵料培养室提供。

1.2试验方法

1.2.1小新月菱形藻浓缩方法

在不同的饵料培养池中培养小新月菱形藻，使其密度分别达到1.0×106cells/ml和2.0×106cells/ml，藻液体积为10 m3。试验时，将浓缩机进藻管口、出藻管口放在饵料池中，将出水管口放入其它空水池中。采用0.10、0.16、0.20 MPa进行浓缩，在浓缩过程中，每隔2 h取样，用血球计数板在显微镜下测定浓缩藻密度。

1.2.2藻类培养及密度测定方法

藻类培养采用f/2培养基进行培养[1]。

藻细胞密度测定：取浓缩藻液样品，用15%的福尔马林溶液固定，血球计数板计数，每个样品设两个平行，取平均值。将所取得的浓缩藻（未使用福尔马林固定）稀释到1.0×106cells/ml，接种在1 L三角烧瓶中，接种体积300 ml，每瓶加营养液0.3 ml，设3个平行，摇瓶4次/d，每天下午14：00测定藻细胞繁殖密度，取样2次，取平均值，试验进行13 d。未浓缩时（0 h）藻细胞繁殖密度作为对照组。

1.2.3K值计算

K=(ln Nt-ln N0)/t。

式中：K——相对生长常数(表示生长效率)；

N0——t时间开始时的细胞数目(×106cells/ml)；

Nt——t经过时间后的藻细胞数目(×106cells/ml);

t——指数生长期所经历的时间（d）。

1.2.4数据分析

采用SPSS11.5软件进行相关性检验，单因素方差分析和Duncan's法多重比较。以P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2　结果

2.1操作压力对小新月菱形藻繁殖的影响

2.1.1起始密度为1.0×106cells/ml浓缩后藻细胞繁殖情况

操作压力为0.10 MPa，不同浓缩时间小新月菱形藻生长情况见图1。由图1可知，各时间组的生长曲线与对照组（0 h）无明显差异，符合藻类一次性培养繁殖规律。经过指数增长期，在第6～7 d藻细胞密度基本上都达到了最大值，各浓缩时间组与对照组藻细胞密度差异不显著（P>0.05）。

操作压力为0.16 MPa，不同浓缩时间小新月菱形藻生长情况见图2。由图2可知，各时间组藻类的繁殖情况与对照组（0 h）基本一致。浓缩6 h和浓缩8 h组在开始培养的第1 d密度稍低于其它各组，出现了延缓期，但是延缓期较短，经过指数增长期和相对生长下降期后，细胞密度与其它各组无明显差异。在第6 d，藻类基本上达到了最大值[(473.1± 9.3)×104cells/ml]。浓缩8 h组与其它各组在第3 d时存在差异，细胞密度为(170.2±2.4)×104cells/ml，低于对照组[(201.6±11.9)×104cells/ml]。

图1　0.10 MPa下浓缩时间对小新月菱形藻生长的影响

图2　0.16 MPa下浓缩时间对小新月菱形藻生长的影响

操作压力0.20 MPa，不同浓缩时间小新月菱形藻生长情况见图3。由图3可知，各时间浓缩组生长曲线与对照组（0 h）存在着差异，这种变化在藻类进入静止期前较为明显。藻类出现了不同程度的延缓期，浓缩8 h组延缓期较其它各组时间长，并且指数增长期不明显。浓缩8 h时间组与对照组存在着显著差异(P<0.05)，第7 d时细胞密度为(476.8±8.9)×104cells/ml，与对照组[(490.0±0.1)×104cells/ml]相比差异不显著。

2.1.2起始密度为2.0×106cells/ml浓缩后藻细胞繁殖情况

操作压力0.10 MPa，浓缩时间对小新月菱形藻生长的影响见图4。由图4可知，藻类在第1～2 d为延缓期，第2～4 d为指数增长期，第4～6 d为相对生长下降期，第6～9 d为静止期，第9～13 d为死亡期。各浓缩时间组与对照组（0 h）生长曲线基本相似，0 h时间组，延缓期较短，其它各组，特别是浓缩8 h组，延缓期较明显。藻类密度在第6 d基本上达到最大值[（485.7±3.0）×104cells/ml]。

图3　0.20 MPa下浓缩时间对小新月菱形藻生长的影响

图4　0.10 MPa下浓缩时间对小新月菱形藻生长的影响

0.16MPa条件下，不同浓缩时间小新月菱形藻生长曲线见图5。由图5可知，生长曲线与0.10 MPa相似，浓缩组与对照组存在着一定的差异，开始培养的第1～2 d和第8 d差异不显著（P>0.05）。第7 d时，浓缩8 h组的藻细胞密度低于对照组（0 h），在第8 d时，差异不显著（P>0.05）。

0.20MPa条件下，不同浓缩时间小新月菱形藻生长情况见图6。由图6可知，各浓缩时间组与对照组其生长曲线上存在着显著的差异。浓缩6 h和浓缩8 h组在1～3 d为延缓期，3～6 d为指数增长期，6～8 d为相对生长下降期，8～11 d为静止期，11～13 d为死亡期。

图5　0.16 MPa下浓缩时间对小新月菱形藻生长的影响

图6　0.20 MPa下浓缩时间对小新月菱形藻生长的影响

浓缩2 h组与对照组（0 h）无明显变化；在进入静止期之前，浓缩6 h组和浓缩8 h组细胞密度低于对照组，但是进入静止期后，细胞密度与对照组差别不大；浓缩6 h组和浓缩8 h组生长曲线相似，但是浓缩8 h组各生长阶段的藻细胞密度始终低于浓缩6 h组。浓缩8 h时间组显著低于其它各组（P<0.05）。浓缩8 h组最大密度为(426.0±4.5)×104cells/ml，显著低于对照组密度[(489.6±7.3)×104cells/ml]（P<0.05）。

2.2操作压力对小新月菱形藻指数生长期K值的影响

在不同压力下，小新月菱形藻指数生长期K值变化见表1和表2。由表1可知，随着浓缩时间的延长，K值逐渐变小；随着压力的增大，K值逐渐变小。0.20 MPa条件下，浓缩6 h和浓缩8 h时间组K值明显低于其它各组。

由表2可知，随着浓缩时间的延长，K值逐渐变小；随着压力的增大，K值逐渐变小。操作压力0.16 MPa和0.20 MPa，浓缩组K值低于其它各组。

表1　小新月菱形藻在不同压力下各浓缩时间组K值（1.0×106cells/ml）

表2　小新月菱形藻在不同压力下各浓缩时间组K值（2.0×106cells/ml）

3　讨论

在一定的操作压力下，浓缩小新月菱形藻再培养生长曲线与标准生长曲线相似（图1），说明藻液在经过浓缩机浓缩之后，大部分藻细胞具有活性，能够繁殖。起使密度为1.0×106cells/ml时，压力对小新月菱形藻的藻细胞活性影响较小。当压力增加到0.20 MPa时，随着浓缩时间的延长，藻细胞再培养后出现了延缓期（图3），但是延缓期后，藻类依然达到了与对照组差异不显著的密度值。藻细胞是活细胞，在进行浓缩过程中，细胞密度不断增大，藻细胞可能产生胞外产物，互相抑制生长，因此再陪养时，藻细胞需要在新的培养液中适应一段时间，因而出现延缓期。另外，藻细胞在浓缩过程中，压力越大，浓缩时间越长，藻细胞在超滤膜上堆积的越厚，部分藻细胞由于挤压作用，产生一定的损伤，因此在0.20 MPa时，浓缩8 h组出现了延缓期。但由于小新月菱形藻细胞外具有硅质的细胞壁[1]，这层硅质的细胞壁对藻细胞起到了一定的保护作用，因此经过了短暂的延缓期之后，藻细胞密度仍然达到了很高的值。

藻液起始密度为2.0×106cells/ml时，随着压力的增大，各个时间组的藻细胞再培养时密度有一定的差异。当压力为0.16 MPa时，各时间组的藻细胞密度在静止期之前有一定的变化，指数生长期生长速度不同，但经过延缓期和指数生长期后，细胞密度与对照组差异不显著(见图5)。操作压力为0.20 MPa时，浓缩6 h和8 h时间组延缓期较长，到达最大密度时的时间为9 d，高于对照组（7 d），且最大细胞密度值低于对照组，说明藻细胞在0.20 MPa压力条件下，超滤膜对藻细胞产生了影响。藻液在浓缩过程中，堆积在超滤膜上的藻细胞不断增加，如果超滤时间短，操作压力低，则堆积速度较慢；相反，操作压力大，超滤时间长，藻细胞在超滤膜上堆积速度加快，并压实，致使部分藻细胞因机械损伤而死亡。因此，藻细胞在8 h浓缩组再培养时，延缓期增加，由于部分藻细胞死亡，因此，藻细胞繁殖速度较低。另外，起始密度较高时，如果采用较高的压力，浓缩时间太长，小新月菱形藻在浓缩过程中不断在超滤膜表面压实，浓差极化现象明显，有可能使超滤膜受到破坏。宫庆礼等[6]研究表明，适宜压力条件下，浓缩后小球藻的总脂和脂肪酸的组分及含量的化学成分损失很小。于淑娟等[10]研究表明，在临界范围内的操作压力可以减少糖分损失。梁茂雨等[11]、纵伟等[12]指出，适合的操作压力对保证黄金梨干酒、黄瓜汁的品质是很重要的。本试验结果表明，合适的操作压力对藻细胞活性影响较小。

4　结论

利用单胞藻饵料浓缩机对小新月菱形藻进行浓缩时，起始密度低，可以采用0.20 MPa进行浓缩；起始密度高，如果采用0.20 MPa进行浓缩，只有采用短时间（低于6 h）浓缩才能不破坏细胞活性，但是，浓缩时间短，藻细胞浓缩密度低，达不到生产要求，因此高密度浓缩时，采用0.16 MPa进行浓缩效果最佳。

参考文献

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[11]梁茂雨，樊振江，高愿军，等.超滤澄清黄金梨干酒的研究[J].食品科学，2007,28（7）：212-214.

[12]纵伟，马歌丽，赵光远.超滤澄清黄瓜汁的研究[J].食品科学，2006，22（7）：118-120.

（编辑：刘占，laramie_liu@139.com）

Effects of ultra-filtration concentration on cell activity in Nitzschiaclosterium

Yu Jianhua, Zhou Wei, Wang Guodong, Ren Shaojie

Abstract：The effects of pressure and density on the cell activity in Nitzschia closterium were re⁃searched in this experiment. The Nitzschia closterium were concentrated under different pressure of 0.10, 0.16 MPa and 0.20 MPa, different initial density of 1.0×106cells/ml and 2.0×106cells/ml to eval⁃uate the effects of pressure and initial density on survival of the filtered microalgae which were culti⁃vated again. The results showed that the cells were growing quickly when the pressures were 0.20 MPa and 0.16 MPa. There were no significant differences in cell activity of the concentrated Nitzschiaclos⁃terium. The results suggested that the Nitzschia closteriubumwhich were concentrated in the reason⁃able pressure would grow well.

Key words：ultra-filtration；Nitzschiaclosterium；pressure；activity

收稿日期：2015-10-09

通讯作者：周玮，教授。

作者简介：于建华，硕士，研究方向为水产动物营养与饲料。

中图分类号：S816.34

文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2016）02-0051-04

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.02.011