超滤法结合纳升液相色谱串联质谱技术分析漏出性胸腔积液中多肽组分

陈世范　杨静波　张敏　李晓鸥　刘晓峰　郭宏华　何成彦　高洪文

摘要漏出性胸腔积液中的多肽和蛋白质等生物分子直接或间接地与机体特定的生理、病理状态相关，反映了肺部或者全身其它部位疾病的信息。本研究利用超滤法将漏出性胸腔积液中的多肽组分进行分离，经脱盐富集后，进行纳升液相色谱串联质谱分析。结果表明，在漏出性胸腔积液中共鉴定到来源于52种蛋白的314条多肽，超过一半的肽段来源于纤维蛋白原，并且许多肽段具有阶梯序列的特征。此外，在来源于胶原蛋白和纤维蛋白原的多肽中还发现了大量的脯氨酸氧化修饰。基因本体论富集分析显示，漏出性胸腔积液多肽组分所属蛋白均具有胞外分泌的属性。本研究给出了漏出性胸腔积液中多肽组的序列、等电点、分子量、翻译后修饰等理化参数的分布特征，为进一步寻找肺部疾病相关的多肽标志物提供了可借鉴的参考数据和分析方法。

关键词多肽组； 超滤； 纳升液相色谱串联质谱； 漏出性胸腔积液

1引 言

胸膜腔是位于肺和胸壁之间的一个潜在的腔隙，正常情况下含有少量起润滑作用的液体。胸腔积液是胸膜腔内液体的产生和吸收失衡，致使过多的液体聚积形成[1]，包含多种由血浆滤过及炎症或上皮细胞释放的蛋白。胸腔积液是临床上常见的征象，既可由胸膜疾病引起，也可由其它脏器病变产生。根据其生化特性，胸腔积液分为漏出液和渗出液[2]。漏出性胸腔积液常见于胸膜毛细血管内静水压增高， 如心力衰竭、缩窄性心包炎、血容量增加、上腔静脉或奇静脉受阻等，或者胸膜毛细血管内胶体渗透压降低， 如低蛋白血症、肝硬化、肾病综合征、急性肾小球肾炎、粘液性水肿等。多是由于静脉回流受阻，使得毛细血管内压增加， 从而生成的大量组织液。而渗出性胸腔积液多由炎症或恶性肿瘤引起。

胸腔积液中的多肽、蛋白质等生物分子直接或间接地与机体特定的生理、病理状态相关，反映了肺部或者全身其它部位疾病的信息[3～5]。相对于胸腔镜引导下的组织活检，获取胸腔积液对患者的损伤很小，属于微创的方法。因此，越来越多的研究将胸腔积液作为寻找与肺部疾病相关生物标志物的理想来源。随着现代质谱技术的发展，液相色谱串联质谱技术已经成为转化医学研究中的主要工具，在寻找特定疾病相关的蛋白、多肽、小分子代谢物等领域发挥着重要作用[6～8]。目前，大多数的相关研究都是针对渗出性胸腔积液（渗出液）中与特定生理病理相关的生物分子[9～11]，鲜有针对漏出性胸腔积液（漏出液）的研究报道，而对其中多肽组分的分析更是缺乏系统研究。

超滤技术是一种压力驱动的膜分离技术，其优点是操作简单，分离效率高，不涉及到相转移，无需添加其它化学试剂，能够最大限度地保持生物活性物质的天然状态[12]。在本研究中，利用超滤技术将漏出性胸腔积液中的多肽组分进行分离，脱盐富集后， 进行纳升液相色谱串联质谱分析。本研究可以为进一步寻找肺部疾病相关的多肽标志物提供可借鉴的参考数据和分析方法。

2实验部分

2.1仪器与试剂

纳升高效液相色谱仪（美国Eksigent Technologies公司）； TripleTOF 5600质谱仪（美国Applied Biosystems公司）； 真空冷冻干燥机； Allegra TM X22R离心机（美国Beckman Coulter公司）； 超滤离心管（MWCO 10 kDa，美国Pall公司）； C18反相色谱捕获柱 （100 μm × 30 mm， 3 μm，美国Eksigent Technologies公司）； C18反相毛细管色谱分析柱（75 μm × 150 mm， 3 μm， 美国Eksigent Technologies公司）； Pierce C18吸头（100 μL， 美国Thermo Scientific公司）。

甲酸、乙腈（HPLC级，美国Sigma Aldrich公司）； Bradford蛋白定量试剂（美国BioRad公司）； 实验用水为经MilliQ纯水仪（美国Millipore公司）制备的超纯水。

2.2胸腔积液的采集和理化指标检测

所有胸腔积液标本的留取均在超聲引导下严格按照胸腔穿刺术操作规范进行，收集的样本经离心10 min （4℃，12000 r/min）去除组织碎片和悬浮细胞，留取适量进行胸水常规生化检测，其余置于 80℃保存。每个样本均按照Light标准判断为漏出液[13]，即蛋白总量<25 g/L，乳酸脱氢酶（LDH）<200 U/L，胸腔积液/血清蛋白比值<0.5，胸腔积液/血清LDH比值<0.6，且Rivalta实验结果均为阴性。

2.4.2质谱条件使用配备纳升喷雾离子源的TripleTOF 5600质谱系统对多肽组分进行分析。使用信息依赖采集方式（Information dependent acquisition， IDA）进行二级质谱扫描，每次IDA循环最多采集35个二级质谱，每张二级质谱的累积时间为80 ms，每次循环时间为2.5 s。

2.5数据分析

将采集到的质谱数据传输到数据处理工作站，并使用ProteinPilot 5.0质谱数据分析软件在SwissProt数据库中进行检索，所选蛋白数据库物种为人。检索参数设置为非酶切、磷酸化强调和生物学修饰。将得到的多肽所属的蛋白质列表上传到基因本体论（http：//geneontology.org/）网站，按照不同的细胞组分（Cell Components）进行富集分类。

3结果与讨论

3.1胸腔漏出液多肽组分的质谱分析

将采集的胸腔积液标本进行胸水常规生化检测，按照Light标准判断为漏出液的样本作为本研究分析的对象[13]。首先采用超滤法将漏出性胸腔积液样本中的小分子物质分离出来，再利用反相C18层析材料将其进一步富集，同时也将样品进行了脱盐处理。再利用纳升液相色谱串联质谱对样品进行分析，所得质谱数据在uniprot 库中的人种（Homo sapiens）蛋白库中检索，共得到314 条序列特异性多肽，质谱中检测到的肽段电荷数2～6。这些肽段的分子量分布在828～6071 Da（图1A），其中大部分分布在1000～3000 Da之间。肽段等电点分布在3.32～12.01（图1B），其中弱酸性的肽段（pI 4.0～5.0）分布较多。结合分子量因素，看出314条肽段的分布并不平均，分别主要集中分布在4个不同等电点区域3.3～4.8，5.2～6.2，6.5～7.1和8.2～11.0（图1C）。

与其它临床样本来源的多肽组学研究[7，14]类似，在漏出性胸腔积液中也发现了许多具有阶梯序列特征的多种肽段。其中，既有在N端递增的多肽，也有在C端递增的多肽。如来源于骨桥蛋白的3个肽段RISHELDSASSEVN，ISHELDSASSEVN，SHELDSASSEVN（图2A）； 以及来源于血清白蛋白的4个肽段DAHKSEVAHRFKDLGEENFKA，DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL，DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAF，DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQY（图2B）。 这些阶梯多肽普遍存在于各种天然体液等临床样本中，常由于体内特定环境下的内源性酶解作用产生，其含量、分布、断裂方式等特征可能与机体特定的生理、病理活动密切相关。例如，Bedin等[15]发现在结直肠肿瘤患者血液中存在大量由特定蛋白酶产生的阶梯多肽，这些阶梯多肽的断裂模式和分布特点具有显著的病理特异性，因此有望作为结直肠肿瘤的新颖特异的标志物。Tian等[16]使用多空二氧化硅纳米颗粒对健康人血浆中的多肽组进行了富集，质谱分析结果显示其中含有阶梯多肽，并指出Chymosin 和Cathepsin D可能是产生这些阶梯多肽的主要内源性蛋白酶。

3.2漏出性胸腔积液多肽的脯氨酸氧化修饰

从数据库检索的结果中还可以发现，在漏出性胸腔积液中的部分多肽发生了多种翻译后修饰的情况，包括磷酸化、脱氨基化、N端焦谷氨酸化、N端乙酰化、甲硫氨酸氧化、双氧化、脯氨酸氧化、丝氨酸脱水化等（图3）。其中，最多的修饰类型为脯氨酸氧化。值得注意的是，所有的脯氨酸修饰都发生在纤维蛋白原和胶原蛋白中，以胶原蛋白为多（表1）。胶原蛋白是肺脏间质组织的主要组成成分之一，胶原蛋白容易被氧化，导致胶原蛋白分子内的结构和生化性质改变，是衰老和许多疾病的病理生理机制的一个关键性决定因素[17，18]。

有研究表明，胶原蛋白等胞外基质成分的降解产物多肽向外周体液中的分泌与肺脏的组织重塑密切相关，因而可以作为许多肺部疾病预后的特异性生物标志物[19]。本研究除了在漏出性胸腔积液中发现大量胶原蛋白降解产物外，还发现了其降解产物中脯氨酸的氧化修饰状态，这为进一步研究将脯氨酸氧化的胶原蛋白等胞外基质成分的降解产物多肽作为特定疾病、生理病理状态的生物标志物提供了基础数据和参照。

3.3漏出性胸腔积液多肽所归属的蛋白质

在漏出性胸腔积液中鉴定到的314条多肽来源于52种蛋白。其中，分别有136、30和9条肽段来源于α纤维蛋白原、β纤维蛋白原和γ纤维蛋白原（图4）。即有超过一半的肽段来源于纤维蛋白原，这与漏出性胸腔积液所处的组织内环境的特异性密切相关。众所周知，纤维蛋白原是一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体分子。经凝血酶等因子作用后可以转化为纤维蛋白而发挥各种生理和病理作用，人体内源性的组织型纤溶酶原激活因子（uPA）和尿激酶（uPA）是降解纤维蛋白的主要因素。在临床研究发现中，恶性胸腔积液中uPA和uPA的含量显著升高，导致纤维蛋白原降解产物明显高于其它非恶性疾病如结核性或心肌梗死患者的积液[20]。

基因本体论（Gene ontology，GO）是一种在生物信息领域中极为重要的方法和工具，可以对海量的生物数据进行整合和重新利用，正逐步成为系统生物学领域中最具代表性的规范化的基因和基因产物特性的术语描绘或词义解释的工作平台[20]。利用基因本体论对漏出性胸腔积液中的多肽组分所属蛋白进行分析（图5），发现均具有胞外分泌的屬性， 这与胸腔积液中含有的大量胞外基质类的蛋白成分相吻合。

4结 论

本研究利用超滤法将漏出性胸腔积液中的多肽组分进行分离，经脱盐富集后，再进行纳升液相色谱串联质谱分析。结果表明，在漏出性胸腔积液中共鉴定到来源于52种蛋白的314条多肽，超过一半的肽段来源于纤维蛋白原，并且许多肽段具有阶梯序列的特征。此外，在来源于胶原蛋白和纤维蛋白原的多肽中还发现了大量的脯氨酸氧化修饰。基因本体论富集分析显示，胸腔漏出液多肽组分所属蛋白均具有胞外分泌的属性。本研究详细描述了漏出性胸腔积液中多肽组的序列、等电点、分子量、翻译后修饰等理化参数的分布特征，为进一步寻找肺部疾病相关的多肽标志物提供了参考数据和分析方法。

AbstractThe peptides， proteins and other biological molecules in transudative pleural effusion correlate directly or indirectly with specific physiological and pathological state， reflecting the information regarding the lungs or other parts of the body. In the present study， the peptide fraction in transudative pleural effusion was isolated by ultrafiltration. After desalted and enriched by C18 tips， the peptide mixture was analyzed by nano LCMS/MS. The results showed that 314 peptides， which were originated from 52 proteins， in pleural transudate were identified. More than half of the peptides were derived from fibrinogen. Many peptides were characterized as displaying ladder sequences. In addition， a large number of proline oxidation modifications were detected in the peptides derived from collagen and fibrinogen. Gene ontology enrichment analysis showed that the most of the proteins extracellular properties of pleural transudate polypeptide components were protein with exocytosis. The study provided a rapid and efficient separation and analysis methods for lung disease markers related peptide compounds in pleural fluid leakage. Also this research provided a rapid and effective method for screening peptide biomarkers related to lung diseases from transudative pleural effusion.

KeywordsPeptidome； Ultrafiltration； Nanoliquid chromatographytandem mass spectrometry； Transudative pleural effusion