基于寡核苷酸链的汞离子荧光生物传感器

刘晨光　王久军　张兴平　杨华林

摘要基于G四链体结构和卟啉类化合物N甲基卟啉二丙酸IX（NMM）结合产生强烈的荧光，利用THgT错配对汞离子（Hg2+）的特异性识别，建立了一种简单、灵敏、高效的Hg2+检测新方法。在富含鸟嘌呤（G）寡核苷酸链中，引入了大量胸腺嘧啶（T）。在没有Hg2+存在时，可以自发形成G四链体结构，与NMM结合产生强烈的荧光； 在Hg2+存在时，可与另一条富含T序列的互补链通过THgT特异性结合， 形成双链DNA分子，从而导致G四链体结构不能产生。优化后最佳实验条件为：缓冲溶液的pH=6.7， 20 mmol/L KCl， 2.5 μmol/L NMM， 反应时间为2 h。在优化条件下，体系的荧光强度变化值与Hg2+浓度呈现良好的线性关系，线性范围为50～1000 nmol/L，检出限为22.8 nmol/L（3σ）。此生物荧光传感器对Hg2+具有良好的选择性。实际水样中Hg2+的加标回收率为106.1%～107.8%，可以满足实际水样品中Hg2+的检测要求。

关键词G四链体； THgT错配； 汞离子； 荧光生物传感器

1引 言

汞是一种常见的重金属污染物，广泛存在于水、空气和土壤中[1]。可通过食物链在人体中富集，引起脑部、肾脏损伤和运动障碍等疾病，极大地威胁着人类健康[2，3]。因此，发展简单、灵敏、快速检测汞离子（Hg2+）浓度的方法具有重要意义。目前，常用的Hg2+检测方法有原子吸收光谱法（AAS）[4]、原子荧光光谱法（AFS）[5]和电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）[6]等，这些方法灵敏度和分辨率可以满足实际检测的需求，但是需要专业的操作人员和大型的仪器设备，不适合常规检测。

G四链体结构是由富含鸟嘌呤的DNA中的4个鸟嘌呤通过氢键相互作用形成笼式结构[7～9]，可与卟啉类化合物N甲基卟啉二丙酸 IX（NMM）结合产生强烈的荧光[10]。与其它发光基团相比，G四链体/NMM复合物作为荧光报告基团，具有廉价、易于制备和储存等优点，已用于检测DNA[11，12]、RNA[13]、生物硫化物[14]和抗癌藥物[15]等。

Hg2+可以特异性地与胸腺嘧啶（T）结合，形成稳定的THgT配位化合物[16，17]。THgT的结合强度甚至超过了正常的TA配对的强度[18]。因此，THgT错配可以作为一种良好的Hg2+识别元件。基于Hg2+通过THgT错配可引起寡核苷酸链结构的变化、替换及重组的现象，研究者构建了许多Hg2+传感器[19]，包括基于荧光基团的荧光传感器[20，21]、基于石墨烯的电化学传感器[22]及基于金纳米粒子的比色传感器[23]，其中有些方法可以实现Hg2+的可视化检测[24]。然而，上述方法中，一般需要对相关材料进行化学修饰或者前处理，过程比较繁琐。

本研究利用THgT特异性结合，基于G四联体/NMM复合物的独特荧光性质，建立了一种无需荧光标记、简单、实用的Hg2+检测方法。

2实验部分

2.1仪器与试剂

3结果与讨论

3.1传感器工作原理及可行性分析

Hg2+传感器原理如图1所示。设计了两条寡核苷酸链P1和P2，P1为富G序列，可以自发形成G四链体结构。 同时，在P1的多聚鸟嘌呤序列中间引入了大量胸腺嘧啶。P2为富含胸腺嘧啶的P1不完全互补链，在Hg2+存在时，可以通过THgT错配，形成双链DNA分子。在无Hg2+存在时，P1自发形成G四链体结构，与反应体系中的NMM结合，产生强烈的荧光。当Hg2+存在时，P1和P2通过THgT特异性结合形成双链DNA分子，阻止G四链体产生，使得体系荧光信号下降，从而实现对Hg2+的检测。

为了验证方法的可行性，测定了不同条件下的荧光光谱，结果如图2所示。当NMM单独存在时，背景信号比较微弱（图2a）。当仅加入P1和P2时，P1不能与P2互补配对形成双链DNA，P1自身形成G四链体结构，与NMM结合产生强烈荧光（图2d）。而当Hg2+存在时， P1和P2通过THgT错配形成稳定的DNA双链，导致P1的G四链体结构不能形成，从而造成荧光强度明显下降（图2c）。实验结果表明，基于上述原理可以实现对Hg2+的检测。

0.2 mol/L Na2HPO4NaH2PO4缓冲液（pH = 6.1）中，加入不同浓度的KCl，室温反应0.5 h，测量荧光信号变化。如图3A所示，在0～10 mmol/L浓度范围内，随着KCl浓度增加，荧光信号大幅提高； 之后荧光强度增长缓慢，KCl浓度为20 mmol/L时，荧光信号达到最大值； 继续增加KCl浓度，荧光信号强度几乎不变。因此，后续实验采用20 mmol/L KCl。

3.2.2NMM浓度的优化由反应原理可知，NMM浓度过低，不能完全结合形成的G四链体结构，造成测定结果不准确； 但是由于NMM自身带微弱的荧光，浓度过大又会产生较大的背景信号，因此需对NMM的用量进行优化。考察不同浓度的NMM的影响，测量荧光信号和本底信号差值的变化F-FNMM（F为加入NMM后的荧光值，FNMM为不加P1时的本底荧光值）。如图3B所示，随着NMM浓度的升高，荧光信号不断增强。当NMM浓度为2.5 μmol/L时，体系的荧光值达到最大。再增加NMM用量，背景信号增强，而体系荧光强度不再增加，造成荧光信号和本底信号差值减小。因此，NMM最佳浓度为2.5 μmol/L。

3.2.3pH值的优化进一步考察了所用Na2HPO4NaH2PO4缓冲液的pH值对测量结果的影响。结果如图3C所示， F0为不加Hg2+的体系的荧光强度， F为加Hg2+后的荧光强度，当pH=6.7时，加入Hg2+前后的荧光变化值（F0-F）达到最大值。因此，本研究选择pH 6.7的磷酸盐缓冲体系。

3.2.4Hg2+反应时间的优化Hg2+存在时，通过THgT特异性结合使P1和P2形成双链DNA分子。对此反应时间进行了优化。在125 nmol/L P1、125 nmol/L P2、0.2 mol/L Na2HPO4NaH2PO4缓冲液（pH 6.7）中加入600 μmol/L Hg2+，室温反应不同时间，然后加入20 mmol/L KCl和2.5 μmol/L NMM，室温反应0.5 h，测量荧光信号变化情况。如图3D所示，随着反应时间延长，荧光信号逐渐下降，反应2 h后，荧光信号趋于稳定，说明此时Hg2+与胸腺嘧啶反应完全。因此，本实验选用2 h作为反应时间。

AbstractA simple， fast and highly sensitive fluorescence analysis method for detection of mercury ion was developed based on Nmethylmesoporphyrin IX（NMM）/Gquadruplex DNA system and specific THgT mismatches. In this strategy， a large number of thymine was introduced into guaninerich oigonucleotides which could form Gquadruplex. In the presence of Hg2+， guaninerich oigonucleotides and complementary strand could form doublestranded DNA molecule by specific THgT mismatch pair， leading to destruction of Gquadruplex DNA structure. In the absence of Hg2+， guaninerich oigonucleotides spontaneously formed Gquadruplex DNA structure that could bound NMM to generate intense fluorescence. Based on the above facts， a sensitive fluorescence biosensor for determination of Hg2+ was fabricated. And the optimal conditions for Hg2+ determination were as follows： buffer solution pH of 6.7， 20 mmol/L KCl and 2.5 μmol/L NMM in buffer and incubation for 2 h. Under the optimal conditions， the fluorescence intensity signal change （F0-F） and the Hg2+ concentration exhibited a linear correlation within 50 nmol/L to 1000 nmol/L range with a low detection limit of 22.8 nmol/L （3σ）. The biosensor exhibited good selectivity toward common metal ions. The developed method was successfully employed to detect Hg2+ in tap water with recovery of 106.1%-107.8%.

KeywordsGQuadruplex deoxyribonucleic acid； ThymineHgthymine mismatches； Mercury ion； Fluorescence Biosensor