酵母菌发酵有机米糠富锗的条件优化

■白晓凯　李艳娇　金英海　张　敏　陈石婷　国传福

（1.延边大学，吉林延边133000；2.珲春市龙裕农业发展集团有限公司，吉林珲春133300）



酵母菌发酵有机米糠富锗的条件优化

■白晓凯1李艳娇1金英海1张敏1陈石婷2国传福2

（1.延边大学，吉林延边133000；2.珲春市龙裕农业发展集团有限公司，吉林珲春133300）

摘要：试验以有机米糠为发酵底物，研究酵母菌对锗的生物富集作用，通过对富锗酵母生物量以及锗含量的测定，对此发酵试验的条件进行优化。试验结果显示：令初始pH值自然，米糠添加量32 g/250 ml、装液量80 ml/250 ml、接种量10%、时间60 h、温度30℃、GeO2添加量为100 mg/l时，优化培养条件所得的富锗酵母菌发酵的有机米糠的有机锗生产水平为11.83 mg/kg。

关键词：有机米糠；发酵；酵母菌；有机锗

1968年，日本科学家浅井彦一等成功地人工合成了有机锗化合物——羧乙基锗倍半氧化物,即Ge-132。在随后的深入研究中发现，Ge-132具有广谱药理活性及抗肿瘤作用，这一发现，为医学界寻找有效而低毒的抗癌药物开辟了又一重要的新领域[1]。

锗的存在形式有两种，即无机锗和有机锗。无机锗对人体和动物均有很大的毒性，禁止作为添加剂大量使用。而锗的许多生理活性作用都是以有机锗的形式发挥作用的。获取有机锗的重要途径之一就是利用微生物转化作用,而酵母菌对锗的生物富集有着很大的优势[2-4]。德国科学家Kehlbeck等发现，持续服用含锗酵母对动物的健康有很大益处[5]。米糠是一种优质的能量饲料[6]，本研究以有机米糠作为富锗酵母菌发酵底物，充分利用其兼具营养价值高、绿色、安全、价廉等优点，在增加其饲喂适口性的同时，更为动物提供了优质的菌体蛋白、绿色安全的有机锗，大大提高了其饲喂价值，在养殖业和人用医药保健领域具有很广阔的应用前景。

1　材料与方法

1.1酵母菌菌株

选用对金属具有较高耐受性且发酵后动物喜食的啤酒酵母。

1.2培养基

固体培养基:PDA培养基。

种子合成培养基:酵母膏3 g、蛋白胨0.5 g、葡萄糖40 g、糊精2.75 g、甘油2.35 g、NH4Cl 2.37 g、(NH4)2SO40.5 g、K2HPO41.92 g、MgSO4·7H2O 0.44 g、蒸馏水1 L，pH值自然。

发酵培养基：有机米糠，营养液（葡萄糖20 g、马铃薯粉20 g、蒸馏水1 000 ml），pH值自然。

1.3培养条件优化筛选

从斜面取一环酵母菌体接种于装有10 ml种子合成培养基的试管中，30℃、静置培养12 h，再按2%接种量接种试管种子，于装有50 ml种子合成培养基并加有透气棉塞的250 ml锥形瓶中扩大培养，培养条件为30℃、200 r/min振荡培养24 h。在发酵培养基中加入GeO2（纯度为99.999%）作为锗源，接种扩大培养后的酵母菌，考察米糠添加量、装液量、接种量、时间、温度、GeO2添加量6个培养条件对有机锗生产水平的影响。

1.4有机锗生产水平的测定

发酵完成后，将锥形瓶中的发酵物用去离子水洗涤并过滤，重复2～3次，取洗涤液进行离心，离心条件为25℃、4 500 r/min、20 min。离心后弃上清液，105℃干燥所得的沉淀物即为酵母菌体干粉。

酵母菌体中的锗大部分以有机锗的形式存在，但也有少量的无机锗。本试验采用静置浸出离心分离法测定富锗酵母中有机锗的含量[5]。取0.2～ 0.3 g酵母菌体干粉，用9 ml蒸馏水将其溶解，静置10 h,然后以3 500 r/min、20 min，反复离心3次，将上清液与下层沉淀分离，上清液中的锗即为无机锗，下层沉淀中的锗为有机锗。将沉淀于65℃的干燥箱中干燥。

取0.100 g酵母菌体干粉加入3 ml浓硫酸，小火进行样品碳化，此时酵母干粉中的有机锗转化为成Ge(SO4)2。碳化完全后加入20 ml H2O2，小火微沸将溶液煮至近透明,此时溶液中的Ge(SO4)2转化为GeO2,加入7 ml NaOH溶液（1 mol/l），小火微沸5 min左右,充分溶解溶液中的GeO2。再用稀HCl（1 mol/l）将溶液调至pH值为6左右,此时溶液为微黄色透明液体。将溶液定容50 ml，采用苯芴酮光度法对上清液及沉淀分别进行测定，即可得到有机锗和无机锗含量[7]。

有机锗生产水平（mg/l）=富锗酵母有机锗含量（mg/g）×发酵米糠酵母菌生物量（g/l）。

2　结果与讨论

2.1米糠添加量对富锗酵母生物量的影响（见图1）

米糠添加量的筛选分为6个组，每组3个平行处理，6个组的米糠添加量分别为24、28、32、36、40 g以及44 g 6个梯度。此筛选的其他试验条件为：装液量70 ml、接种量4%、时间48 h、温度28℃。

由图1可知，米糠添加量为24～32 g时，酵母菌生物量随米糠添加量的增加而增大，当米糠添加量为32 g时，酵母菌生物量达到最大0.58 g/100 ml；米糠添加量为32～44 g时，酵母菌生物量反而随米糠添加量的增大而降低。通过对各组发酵过程中状态改变的观察分析可得，米糠添加量为24～32 g时，由于发酵物含水量过多，米糠量较少，造成发酵物因供氧及营养成分不足，使得酵母菌无法充分地进行有氧呼吸，无氧呼吸的产物又进一步抑制了发酵物的发酵，最终导致生物量较少；米糠添加量在32 g以上时，由于发酵物含水量不足，米糠量过多，造成发酵物结块，使得酵母菌无法充分与氧气接触，最终导致生物量较少。因此确定米糠添加量为32 g/250 ml。

2.2装液量对富锗酵母生物量的影响（见图2）

装液量的筛选分为6个组，每组3个平行处理，6个组的营养液添加量分别为60、70、75、80、85 ml以及90 ml 6个梯度。此筛选的其他试验条件为：米糠添加量32 g、接种量4%、时间48 h、温度28℃。

由图2可知，营养液添加量即装液量为60～80 ml时，酵母菌生物量随装液量的增加而增大，并于80 ml时达到最大值0.611 g/100 ml；随着装液量的继续增加，酵母菌生物量开始出现下降趋势。通过对各组发酵过程中状态改变的观察分析可得，装液量在80 ml以下时，由于含水量不足使得发酵物结块，进而导致酵母菌供养不足，加之营养成分的不足，两方面原因导致酵母菌生长受到抑制；当装液量大于80 ml时，由于含水量过高，使得发酵物无法充分膨胀，从而使得酵母菌无氧呼吸比例过高，无氧呼吸代谢物又进一步抑制了酵母菌的生长繁殖，最终导致生物量下降[8-9]。因此，确定最适装液量为80 ml/250 ml。

2.3接种量对富锗酵母生物量的影响(见图3)

图3　接种量对富锗酵母生物量的影响

接种量的筛选分为6个组，每组3个平行处理，6个组的接种量分别为4%、6%、8%、10%、12%以及14% 6个梯度。此筛选的其他试验条件为：米糠添加量32 g、装液量80 ml、时间48 h、温度28℃。

由图3可知，接种量小于10%时，酵母菌的生物量随发酵时接种量的增加而增大，并于接种量为10%时达到最大值0.798 5 g/100 ml；但随着接种量的继续增加，酵母菌生物量不再增大，甚至出现了下降趋势。这可能是由于过量的酵母菌提前消耗完培养基中的营养成分，从而提早进入了死亡期所致。因此确定最适接种量为10%。

2.4培养时间对富锗酵母生物量的影响(见图4)

图4　培养时间对富锗酵母生物量的影响

培养时间的筛选分为6个组，每组3个平行处理，6个组的培养时间分别为24、36、48、60、72 h以及84 h 6个梯度。此筛选的其他试验条件为：米糠添加量32 g、装液量80 ml、接种量10%、温度28℃。

由图4可知，在培养时间为24～60 h的范围内时，酵母菌的生物量随着培养时间的延长而增大，且在培养60 h时达到最大值0.989 g/100 ml；随着培养时间继续延长，酵母菌的生物量出现下降趋势。这与酵母菌生长对数曲线有着直接关系[10]。因此，确定最适培养时间为60 h。

2.5培养温度对富锗酵母生物量的影响(见图5)

图5　培养温度对富锗酵母生物量的影响

培养温度的筛选分为6个组，每组3个平行处理，6个组的培养温度分别为28、29、30、31、32℃以及33℃6个梯度。此筛选的其他试验条件为：米糠添加量32 g、装液量80 ml、接种量10%、时间60 h。

由图5可知，培养温度在28～30℃时，酵母菌生物量随培养温度的上升而增大，且于30℃时达到最大值1.318 g/100 ml；但随着温度的继续上升，酵母菌生物量开始出现下降趋势。酵母菌在有氧环境中是以出芽方式进行增殖的，但是酵母菌只能够在一定温度下存活，且在一定的温度范围内，温度越高，酵母菌生长繁殖得越快，衰亡的速度也随温度的升高而加快，在40℃时酵母菌会停止出芽[11]。从本试验得到的数据来看，可以确定在试验设定的环境中，最适的发酵温度为30℃。

2.6GeO2添加量对富锗酵母生物量及有机锗生产水平的影响(见图6)

GeO2添加量的筛选分为6个组，每组3个平行处理，6个组的GeO2添加量分别为60、80、100、120、140 mg/l以及160 mg/l 6个梯度。此筛选的其他试验条件为：米糠添加量32 g、装液量80 ml、接种量10%、时间60 h、温度30℃。

由图6可知，随着GeO2添加量的增加，酵母菌的生物量呈现下降趋势，这可能是由于高浓度的GeO2抑制了酵母菌正常的生长代谢，导致其生物量减少。但在GeO2添加量为60～100 mg/l范围内，有机锗生产水平呈现上升趋势，并于GeO2添加量为100 mg/l时达到最大值11.83 mg/l；随着GeO2添加量的继续增加，有机锗生产水平开始呈现下降趋势。因此，GeO2最适添加量为100 mg/l。

图6　GeO2添加量对富锗酵母生物量及有机锗生产水平的影响

2.7发酵米糠营养成分分析（见表1）

表1　普通有机米糠与酵母菌发酵有机米糠营养成分分析(%)

由表1可知，经酵母菌发酵后的有机米糠的粗蛋白所占比例显著增加（P<0.05）；钙所占比例也有所增加，但差异不显著；其他营养成分所占比例都有不同程度的降低。有机米糠经酵母菌发酵后，发酵米糠中含有丰富的酵母菌体蛋白，使得其粗蛋白含量增加。

3　结论

本研究通过一系列的条件筛选试验，将最优条件进行组合，获得了在发酵起始pH值自然时富锗酵母菌发酵有机米糠的优化条件：有机米糠添加量32 g/250 ml、装液量80 ml/250 ml、接种量10%、时间60 h、温度30℃、GeO2添加量为100 mg/l。优化培养条件所得的富锗酵母菌发酵的有机米糠的有机锗生产水平为11.83 mg/kg。

参考文献

[1]陈红专,孙琛.有机锗药理作用的研究[J].中国药理学通报,1990 (6):341-343.

[2]白明章,耿立峰,孙丽娟.具有生物活性的有机锗化合物及其合成方法[J].化学通报,1987(11):23-28.

[3]魏秀生.酵母对锗的生物富集作用[J].食品科学,1992(5):49-54.

[4]唐博恒,莫卓寿,黄诗旦,等.高锗酵母的研究[J].解放军预防医学杂志,1994(3):179-183.

[5] Kehlbeck，Heinrich. Here mit einern Gehalt eines Metalls and Verfahren ZU deren Herstellung.Gev Offen DE. 334521[A]. 1985-06-27.

[6] Donald E P. Rice: not just for throwing[J]. Food Tech., 2001,55(2): 53-58.

[7]金婵,郝素娥,孙丽欣,等.高铬酵母的制备及其有机铬含量的研究[J].营养学报,2002(3):282-285.

[8]洪长根.探究酵母菌细胞呼吸方式的三个实验设计方案[J].生物学教学,2009(7):37-39.

[9]杨涌.酵母菌细胞质基质有氧时能将葡萄糖分解产生酒精和二氧化碳[J].生物学教学,2015（1）:67-68.

[10]王秋菊,许丽,崔一喆,等.酵母菌生长曲线的测定及不同生长时间麦芽汁糖度的变化[J].兽药与饲料添加剂,2006（1）:8-9.

[11]陈维.探究温度对酵母菌种群数量的影响[J].生物学通报,2008 (12):46-48.

（编辑：刘占，laramie_liu@139.com）

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Optimization of germanium accumulation conditions by yeast to ferment the organic rice bran

Bai Xiaokai, Li Yanjiao, Jin Yinghai, Zhang Min, Chen Shiting, Guo Chuanfu

Abstract：The experiment took the organic rice bran as the fermentation substrate to study the biologi⁃cal accumulation function of the yeast to germanium. The biomass and germanium-enriched yeast were measured for optimizing the experiment conditions. The result showed: under the optimized condi⁃tions that the initial pH value was unchanged, the filling volume of organic rice bran was 32 g/250 ml, the filling volume of liquid medium was 80 ml/250 ml, the inoculum was 10%(v/v), the cultural time was 60 h, the cultural temperature was 30℃, GeO2concentration was 100 mg/l, the organic germani⁃um production-level of the organic rice bran fermented by yeast was 11.83 mg/kg.

Key words：organic rice bran；fermentation；yeast；organic germanium

收稿日期：2015-10-26

通讯作者：张敏，教授，硕士生导师。

作者简介：白晓凯，硕士，研究方向为生物饲料添加剂的开发与应用。

中图分类号：S816.6

文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2016）02-0047-04

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.02.010