红枣叶中三萜皂苷的提取工艺和含量测定研究

刘子祯，姜蕊，刘伟锐，沈蒙，谢梦，徐冠玲，颜承，宋燕，张霞，杨悦，折改梅，*（.北京中医药大学中药学院，北京000；.宁夏医科大学药学院，宁夏银川750004）



红枣叶中三萜皂苷的提取工艺和含量测定研究

刘子祯1，姜蕊1，刘伟锐1，沈蒙1，谢梦1，徐冠玲1，颜承1，宋燕2，张霞1，杨悦1，折改梅1，*
（1.北京中医药大学中药学院，北京100102；2.宁夏医科大学药学院，宁夏银川750004）

摘要：研究红枣叶三萜皂苷的提取工艺和含量测定方法。最佳提取工艺为50 %乙醇水溶液，液料比10∶1（mL/g），回流提取1.5h；枣叶三萜皂苷含量为9.208%，RSD=2.26%。

关键词：红枣叶；三萜皂苷；提取工艺；含量测定

红枣叶为鼠李科枣属（Ziziphus）植物枣（Ziziphus jujube Mill.）的干燥树叶，性温、味甘，清热解毒，主治小儿壮热，疮疖等[1-2]。枣叶极具营养价值和药用价值，富含皂苷类活性成分[3-4]，在减肥[5-6]、降血糖[7]和宁心安神方面具有独特功效[8]。另外，目前市售的甜味抑制剂都是通过化学合成的，然而枣叶中三萜皂苷如酸枣仁皂苷B、jujubasaponins、ziziphin皂草苷等具有突出的甜味抑制作用[9-10]，其通过竞争味觉受体来阻断人的甜味反应[11]，有望开发成月饼、糖果等甜食中的天然甜味抑制。然而，每年收获红枣时，大量枣叶被视作废物丢弃或烧毁，造成资源浪费和环境污染[6]。本研究对枣叶三萜皂苷进行了提取工艺考察，建立了三萜皂苷含量测定方法，对今后枣叶的开发利用具有重要意义。

本研究首次采用正交设计考察枣叶皂苷提取工艺并进行统计分析，确定了最佳提取工艺；优化了香草醛-冰乙酸比色法的显色条件；建立了红枣叶中三萜皂苷含量测定的方法，为合理利用枣叶资源奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

红枣叶采自陕西省榆林市，经笔者鉴定为枣（Ziziphus jujube Mill.）的干燥树叶。人参皂苷Re对照品（含量以98 %计）：购自北京鑫科奥商贸有限公司；乙醇、冰乙酸、香草醛和高氯酸均为分析纯。

TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用有限责任公司；AL204和XS205精密电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士；DK-S24型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；移液器：德国Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1供试品溶液制备

精密称取干燥枣叶10.001 4 g，用50 %乙醇按液料比10∶1（mL/g）回流提取1.5 h，过滤，稀释1倍，即得供试品溶液。

1.2.2对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Re对照品2.32 mg于10 mL的量瓶溶解，定容至刻度，摇匀，即对照品溶液。

1.2.3测定波长的选择

精密吸取供试品溶液30 μL，对照品溶液1.0 mL，挥干溶剂，分别加入的50 g/L香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，混匀，60℃水浴加热30 min，冷却至室温；分别加入冰乙酸5.0 mL，摇匀，静置40 min。在450 nm~600 nm范围进行全波长扫描，结果供试品和对照品均在532.0 nm处有最大吸收。因此，最大吸收波长为532.0 nm。结果见图1。

图1供试品溶液和对照品溶液显色后的紫外吸收图Fig.1 The UV graphs of test solution and reference solution after adding color-developing agent

1.2.4标准曲线的制作

精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL对照品溶液，挥干溶剂，分别加入50 g/L香草醛-冰乙酸0.2 mL和高氯酸0.8 mL，摇匀；于60℃恒温水浴加热30 min，取出冷却，分别加入5 mL冰乙酸，摇匀，静置40 min，以空白为对照，在532.0 nm下测定吸光度。以吸光度值为纵坐标y，对照品溶液的浓度为横坐标x做标准曲线，得回归方程：y = 20.393x + 0.0047，r = 0.999 3（n = 6），线性范围为9.6 μg/mL~34.1 μg/mL。

1.2.5显色条件的选择

1.2.5.1显色剂50 g/L香草醛-冰乙酸用量的考察

精密移取供试品溶液5份，每份30 μL，按1.2.4项的方法操作，香草醛-冰乙酸的加入量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL。在532.0 nm处测定吸光度，结果依次为0.451、0.472、0.458、0.462、0.447。故50 g/L香草醛-冰乙酸的最佳用量为0.2 mL。

1.2.5.2显色剂高氯酸用量的考察

精密移取供试品溶液5份，每份30 μL，按1.2.4项的方法操作，高氯酸的加入量分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL。在532.0 nm处测定吸光度。结果依次为0.416、0.470、0.461、0.453、0.406。故高氯酸的最佳用量为0.8 mL。

1.2.5.3显色温度的考察

精密移取供试品溶液4份，每份30 μL，按1.2.4项的方法操作，水浴温度分别为50、60、70、80℃。结果发现被测样品吸光度值与水浴加热温度呈正相关，并且当温度超过60℃后，空白溶液逐渐变黄，且在532.0 nm附近无最大吸收，故选60℃为最佳水浴温度。

1.3方法学考察

1.3.1精密度

精密移取供试品溶液5份，每份30 μL，按1.2.4项的方法操作，在532.0 nm处测定吸光度，其值依次为0.470、0.471、0.472、0.472、0.473。可得RSD = 0.24 % （n = 5），说明精密度良好。

1.3.2显色稳定性

精密移取供试品溶液30 μL，按1.2.4项的方法操作，在显色后0~120 min内每隔10 min测定吸光度值。结果表明供试品在显色后的40 min~120 min内稳定，RSD = 1.13 %。

1.3.3重复性

精密称取干枣叶5份，每份约10.0 g，按2.1项方法制备供试品溶液，分别取30 μL，按1.2.4项方法操作，在532.0 nm波长处测定吸光度，其值依次为0.475、0.489、0.482、0.483、0.461、0.467，RSD = 2.22 %（n = 6），说明重复性良好。

1.3.4加样回收率

精密移取5份已知含量的供试品溶液，每份30 μL（皂苷含量138.12 μg），再分别加入0.232 mg/mL人参皂苷Re对照品溶液250 μL，按1.2.4项方法操作，在532.0 nm处测定吸光度。结果显示平均加样回收率为100.36 %，RSD = 2.55 %（n = 5），说明该方法测定结果准确可靠。结果见表1。

表1加样回收率试验结果Table 1 Results of recovery test

2结果与分析

2.1提取工艺正交试验设计及方差分析

枣叶皂苷提取工艺正交试验结果见表2。

表2提取条件正交试验设计Table 2 The orthogonal design for extraction conditions

由表2可知，三因素的极差大小顺序为A > B > C，即三个因素对三萜皂苷提取率影响的大小顺序为A（液料比）> B（乙醇浓度）> C（提取时间）。

表3方差分析Table 3 The analysis of variance

由表3方差分析的F值可知，3个因素中，A（液料比）对枣叶三萜皂苷提取结果有显著影响（P = 0.04 < 0.05），其他二因素则影响较小。该结果与直观分析结果一致，因此，最佳工艺参数为A3B1C2，即液料比为10∶1（mL/g），乙醇水溶液浓度为50 %，回流提取时间为1.5 h。

2.2样品含量测定

精密称取5份供试品，每份10.0 g，按2.1项方法制备供试品溶液，分别从每份中吸取30 μL，按1.2.4下方法操作，在532.0 nm处测定吸光度，测得红枣叶中三萜皂苷含量为9.208 %，RSD = 2.26 %。结果见表4。

表4样品含量测定结果Table 4 Results of content determination

3　结论

本研究采用L9（34）正交设计对枣叶皂苷提取工艺进一步优化，并对结果进行了直观分析与方差分析，得出红枣叶皂苷提取最佳工艺为：液料比10∶1（mL/g），50 %乙醇水溶液回流提取1.5 h。首次采用香草醛-冰乙酸、高氯酸法测定红枣叶中三萜皂苷的含量，确定出最佳显色条件：50 g/L香草醛-冰乙酸用量为0.2 mL、高氯酸用量为0.8 mL、加热温度为60℃。该方法重复性好，对仪器要求低，稳定可靠，为枣叶皂苷的工业化提取和进一步开发和利用提供了参考。

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Study on the Extraction Approach and Determination of Triterpene Saponins in the Leaf of Ziziphus jujuba Mill.

LIU Zi-zhen1，JIANG Rui1，LIU Wei-rui1，SHEN Meng1，XIE Meng1，XU Guan-ling1，YAN Cheng1，SONG Yan2，ZHANG Xia1，YANG Yue1，SHE Gai-mei1，*
（1. School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；2. College of Pharmacology，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

Abstract：A extraction process and a determination method of triterpene saponins in Ziziphus jujuba leaves was researched. The optimum extraction process of saponins was as follow：50 % aqueous ethanol，solvent to medicine was the ratio of 10∶1（mL/g），reflux extraction time was 1.5 h. The triterpene saponins content in the leaf of Ziziphus jujuba was 9.208 %，RSD = 2.26 %.

Key words：Ziziphus jujuba Mill.；triterpene saponins；extraction procedure；determination

收稿日期：2014-08-31

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.015

作者简介：刘子祯（1990—），男（汉），在读硕士，研究方向：中药化学。*通信作者：折改梅，副教授，博导。

基金项目：陕西红枣树叶中黄酮制备技术研究及产业化技术服务（535/03578）