HPLC法测定新疆胀果甘草全草中甘草查尔酮A的含量

西力扎提·阿不来提，杨旭超，木合布力·阿布力孜，任丙昭(新疆医科大学药学院药物化学有机教研室，乌鲁木齐　830011)



HPLC法测定新疆胀果甘草全草中甘草查尔酮A的含量

西力扎提·阿不来提，杨旭超，木合布力·阿布力孜*，任丙昭(新疆医科大学药学院药物化学有机教研室，乌鲁木齐830011)

摘要：目的对新疆胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat)全草中甘草查尔酮A(Lico A)进行含量测定。方法用HPLC法对胀果甘草根、茎和叶中Lico A的含量进行测定。色谱柱：依利特 Hypersil ODS2 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)配预柱；流动相：甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)；流速:1.0 mL·min-1;柱温：25 ℃;检测波长：372 nm。结果Lico A质量浓度在6.937 5~111 μg·mL-1范围内线性关系良好(r=0.999 9)；平均加样回收率99.6%，RSD=1.5%；按此法测得的Lico A含量在根中为0.468%，茎中为0.254%，而在叶中未检出。结论甘草查尔酮A在甘草中主要分布在根和茎中，茎也可作为获取Lico A的新资源。

关键词：新疆胀果甘草；甘草全草；甘草查尔酮A；高效液相色谱

甘草是豆科植物中的多年生草本植物之一，在我国被广泛应用和开发有4 000多年的历史，被记录在许多国家的药典中，包括美国[1]、日本[2]和其他国家[3]。在我国传统医学中至少70%的处方都含有甘草。《中国药典》(2015年版一部)记载其原属植物包括2种，即胀果甘草(GlycyrrhizainflataBat)和光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)，其中胀果甘草在新疆地区资源分布较为多见[4]。甘草查尔酮A(Lico A)是一种含氧的查尔酮，也是胀果甘草的特异性成分之一，Lico A被认为是治疗寄生虫、 疟疾和利什曼病[5-7]的潜在候选药物[8]。Lico A具有抗炎、抗氧化、抗免疫力及抗肿瘤作用[9]，具有比较良好的抗癌活性，诸多研究表明， Lico A显示出较为明显的抗前列腺癌和抗乳腺癌活性，并且能够有效地抑制癌细胞在机体内的扩散及转移[10-13]。这些研究结果表明，甘草中的查尔酮类单体Lico A在抗癌创新药物的研究中具有潜在的深入研究价值。然而，Lico A在胀果甘草中的含量很低，人工合成方法的工艺路线复杂，制备成本很高[14-15]。这促使人们去寻找Lico A的新资源和新来源。我国学者崔永明等[14]早已建立了Lico A的HPLC含量测定方法，本文运用了此方法对胀果甘草全草各部位中Lico A的含量进行分析，并根据结果探讨胀果甘草全草的综合开发利用思路。

1仪器与试药

1.1仪器LC-20AB泵，N-1001型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；AB104-N电子天平(Mettler-Toledo Group)；高效液相色谱仪，SPD-20A紫外检测器(日本岛津公司)；DT200型电子分析天平(常熟市衡器厂)；SK2510HP型数控超声清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2试药新疆胀果甘草(2014年8月分别采集自南疆地区的各个甘草基地，如新疆巴楚、新和、和田)，用薄层方法鉴定为胀果甘草[16]。甲醇为色谱纯；水为屈臣氏纯净水；Lico A对照品(美国Sigma公司，批号803529)质量分数≥99%；无水乙醇、甲醇和冰醋酸均为分析纯；蒸馏水为自制。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱:Hypersil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)配预柱；流动相：甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)；检测波长：372 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃。

2.2Lico A对照品溶液的制备称取干燥恒质量的Lico A对照品(120 ℃)11.1 mg，精密称量，置于10 mL量瓶中，用体积分数为60%的甲醇溶液溶解配制成质量浓度为1.11 mg·mL-1的溶液；从上述配液中精密吸取2 mL，置于10 mL量瓶中，用体积分数为60%的甲醇溶液溶解，配制成质量浓度为0.222 mg·mL-1的对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备分别称取已粉碎好的甘草茎、根、叶20 g(过60目筛)，置于250 mL圆底烧瓶中，加入甲醇溶液150 mL， 超声处理30 min(功率400 W，频率59 kHz)，过滤，再加入甲醇100 mL，超声处理30 min，两者合并滤过，减压并浓缩至干燥，精密称取10.7 mg，置于10 mL量瓶中，加体积分数为60%的甲醇溶液溶解并定容至刻度，振荡摇匀；经微孔滤膜(孔径为0.45 μm)滤过,弃去初滤液,得到续滤液,即供试品溶液。

2.4线性关系考察精密吸取Lico A对照品储备液，质量浓度由低到高配制成6.937 5，13.875，27.75, 55.5和111 μg·mL-1的溶液，依次分别进样10 μL，按照上述色谱条件测定待测物的峰面积。以质量浓度C(μg·mL-1)对主峰的峰面积(A)进行线性回归，得回归方程：Y=36 192X+30 278 (r=0.999 9)，Lico A进样量在6.937 5~111 μg范围内线性关系良好。

2.5精密度实验精密吸取2.2项下的对照品溶液10 μL，在2.1项下的色谱条件下测定待测物的峰面积，连续进样6次，结果显示， 其精密度较为良好，Lico A的RSD为1.74%。

2.6重复性实验取同一批次的样品，按照2.3项下方法制备6份样品溶液，在2.1项下的色谱条件下测定待测物的峰面积，结果显示，甘草根部分中Lico A的平均含量为4.63 mg·g-1，RSD为1.84%，其重复性较为良好。

2.7稳定性实验精密吸取2.3项下同一供试品溶液，在2.1项色谱条件下测定峰面积，在0，2，4，8，12和24 h测定峰面积，其RSD为2.27%，研究表明，供试品溶液中的Lico A在24 h内稳定。

2.8加样回收率实验取同一已知Lico A含量的供试品溶液6份约0.1 g，精密加入质量浓度为0.41 mg·mL-1的Lico A对照品1 mL，按照2.3项下方法处理，得供试品溶液。按照标准法进行测定并计算待测物的含量，结果见表1。

表1回收率实验结果

Tab.1 The results of recovery test

(n=6)

2.9样品测定分别精密称取胀果甘草3个不同部位的样品，按照2.3项下方法测定，计算Lico A的含量，结果表明，甘草根中Lico A的平均含量为0.468%，甘草茎中Lico A的平均含量为0.254%，而甘草叶中未检出Lico A。

色谱图见图1。

图 1 HPLC 图

a.对照品；B.样品；1.甘草查尔酮A

Fig.1 HPLC chromatograms

a. reference substances；B. sample；1. licochalcone A

3讨论

Lico A是胀果甘草中的一种特异性成分，研究表明， Lico A具有明显的抗前列腺癌和抗乳腺癌活性，并能抑制癌细胞的扩散转移[10-13]。然而，胀果甘草中Lico A的含量很低，用化学方法人工合成使成本更高且工艺路线更复杂[14-15]。这促使人们寻找Lico A的新资源和新来源。

本实验在文献方法[14]的基础上，优化了实验条件，并利用HPLC法对新疆胀果甘草全草进行Lico A的分布特征研究，并发现了全草中Lico A的新存在部位。首先分别对已鉴定的胀果甘草根、茎、叶用甲醇提取进行制备，然后利用HPLC法，以Lico A为对照品，用已有的色谱条件，以甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)为流动相进行含量测定，结果胀果甘草根和茎中Lico A的含量分别为0.468%和0.254%，而甘草叶中没有显示出该特征峰。

新疆胀果甘草全草中查尔酮类活性成分Lico A的含量测定未见文献报道，因此本研究结果具有重要意义。从胀果甘草中提取制备Lico A时，合理利用甘草茎，在保护甘草资源及甘草地上部分的综合开发利用中具有一定的价值。本研究结果显示，在抗癌活性成分Lico A新资源的研究中、促进胀果甘草茎的药用开发利用中、甘草根资源保护中以及胀果甘草品种的快速鉴定研究中，将体现出其重要的意义。

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Determination of licochalcone A in whole plant of XinjiangGlycyrrhizainflateby HPLC

Shirzat ABLAT, YANG Xuchao, Mourboul ABLISE*, REN Bingzhao(Department of Medicinal Chemistry, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Abstract:Objective To measure the content of licochalcone A in the whole plant of Glycyrrhiza inflata Bat (GIB) from Xinjiang origin．Methods HPLC method was used to perform a quantitative analysis of licochalcone A content in the root, stem and leaves of GIB plant. Hypersil ODS2 C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used; the mobile phase was composed of methanol-water-glacial acetic acid (60∶40∶1) mixture , with a flow rate of 1.0 mL·min-1; the detection wavelength was 372 nm at 25 ℃. Results Licochalcone A was linear in the concentration range of 6.937 5-111 μg·mL-1(r=0.999 9); the average recovery rate was 99.6% with corresponding RSD of 1.5%. The content of licochalcone A in the root was 0.468%, and in the stem was 0.254%, however licochalcone A was not detected in the leaf. Conclusion Licochalcone A is mainly distributed in the root and stem of Glycyrrhiza inflata Bat. The stem may be a new resource of licochalcone A.

Key words:Glycyrrhiza inflata Bat;licorice whole plant; licochalcone A; HPLC

(收稿日期：2015-10-26)

*通信作者：木合布力·阿布力孜，男，博士，教授，博士生导师

作者简介：西力扎提·阿不来提，男，在读硕士研究生

基金项目：国家自然科学基金项目(编号：81260379)

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)02-0130-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.006