三种实验室检测方法在儿童传染性单核细胞增多症的诊断应用

邓坤仪　彭建明　范汉恭　杨海霞　吴键卓



三种实验室检测方法在儿童传染性单核细胞增多症的诊断应用

邓坤仪1★彭建明1范汉恭1杨海霞1吴键卓2

［摘要］目的探讨EB病毒-DNA（Epstein-Barr virus-deoxyribonucleic acid，EBV-DNA）载量、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）抗CA-IgM（IgM to Epstein-Barr viral capsid antigens，CA-IgM）及异型淋巴细胞计数在儿童传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM）中的诊断意义。方法对116例IM患儿EBV-DNA载量、抗CA-IgM、异型淋巴细胞计数的敏感性和特异性进行比较。结果

IM患儿EBV-DNA载量的敏感性为85．34%，特异性为96．00%；抗CA-IgM的敏感性为84．48%，特异性为94．00%；外周血异淋细胞比例≥10%占39．66%，特异性为100．00%。抗CA-IgM联合异型淋巴细胞检测的敏感性为88．79%，特异性为94．00%。EBV-DNA载量联合异型淋巴细胞检测的敏感性为88．79%，特异性为96．00%。抗CA-IgM联合EBV-DNA载量检测的敏感性为93．10%，特异性为90．00%。EBVDNA载量和抗CA-IgM诊断儿童IM的敏感性明显高于异型淋巴细胞检测（χ2分别为46．05和43．61，P＜0．05），三者的特异性较高。结论EBV-DNA载量、抗CA-IgM和异型淋巴细胞计数两两联合检测，可提高儿童IM的诊断。

［关键词］传染性单核细胞增多症；EB病毒抗体；EB病毒DNA；异型淋巴细胞

作者单位：1．中山市博爱医院检验科，广东，中山528403

2．南方医科大学医学检验（临床方向），广东，广州510515

Application of 3 laboratory tests in the diagnosis of infectious mononucleosis in children

DENG Kunyi1★, PENG Jianming1, FAN Hangong1, YANG Haixia1, WU Jianzhuo2
(1. Department of Clinical Laboratory, Boai Hospital of Zhongshan City, Zhongshan, Guangdong, China, 528403; 2. Clinical Medical Laboratory, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 510515)

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the diagnostic significance of Epstein-Barr virus-deoxyribonucleic acid (EBV-DNA), EBV CA-IgM and atypical lymphocytes in children with infectious mononucleosis (IM). Methods116 children with IM and 50 healthy controls were studied, and the sensitivity and specificity of EBV-DNA, EBV CA-IgM and atypical lymphocytes were calculated, and compared. Results The sensitivity of EBV-DNA, EBV CA-IgM, and atypical lymphocytes in 116 children with IM were 85.34%, 84.48% and 39.66%, respectively. The specificity of EBV-DNA, EBV CA-IgM and atypical lymphocytes were 96.00%, 94.00% and 100.00%, respectively. The sensitivity of pair covering test with combined EBV CA-IgM and atypical lymphocytes, combined EBV-DNA and atypical lymphocytes, or combined EBV CA-IgM and EBV-DNA was 88.79%, 88.79% or 93.10%, respectively. The specificity of pair covering test with combined EBV CA-IgM and atypical lymphocytes, combined EBV-DNA and atypical lymphocytes, or combined EBV CA-IgM and EBVDNA was 94.00%, 96.00% or 90.00%, respectively. The sensitivity of EBV-DNA and EBV CA-IgM were significantly higher than that of atypical lymphocytes (P<0.05). All of the 3 methods had high specificity. Conclusion Pair covering test with combined EBV CA-IgM and atypical lymphocytes, combined EBV-DNA and atypical lymphocytes, or combined EBV CA-IgM and EBV-DNA may improve the diagnosis of IM in children.

［KEY WORDS］Infectious mononucleosis; Epstein-Barr virus antibody; Epstein-Barr virus DNA; Atypical lymphocyte

传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM）是指主要由EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染引起的单核-巨噬细胞系统增生性传染病［1］。IM时EBV主要感染B细胞，继之引起T细胞的免疫反应，形成周围血中可见到的异型淋巴细胞［2］。本病好发于青年及儿童，临床表现为发热、咽峡炎、淋巴结和肝脾肿大等［3］。病程常具有自限性，多数预后良好，少数患儿出现严重并发症，引起后遗症，甚至导致死亡。由于病变可涉及血液系统、神经系统、消化系统、呼吸系统等，临床表现变化多端，症状多样化，早期常易误诊或漏诊。为了解3种实验室检测方法在儿童IM诊断的意义，本文对我院临床诊断为IM并治愈的116例患儿的EBV-DNA载量、抗CA-IgM及异型淋巴细胞计数结果进行比较分析，现报道如下。

1　材料与方法

1．1研究对象

收集2013年12月至2014年12月在中山市博爱医院临床首次诊断为IM并治愈的116例住院患儿，符合IM临床诊断标准［2］，并在IM用药治疗前进行抽血检验。其中男性83例，女性33例；发病年龄6个月至13岁，其中6月至1岁3例（2．59%），＞1岁～3岁50例（43．10%），＞3岁～6岁41例（35．34%），＞6岁～13岁22例（18．97%）。对照组为正常体检健康儿童50例，男29例，女21例，年龄6月～13岁。

1．2IM的诊断标准［2］

根据第8版《诸福棠实用儿科学》，IM的诊断标准如下：（1）临床诊断病例：满足下列Ⅰ中任意3项及Ⅱ中第4条。（2）实验室确诊病例：满足下列Ⅰ中任意3项及Ⅱ中第1条～第3条中任意一条。Ⅰ．临床症状：①发热；②咽峡炎；③颈淋巴结肿大，④肝脏肿大；⑤脾脏肿大；⑥眼睑水肿。Ⅱ．实验室检查：①抗CA-IgM和抗CA- IgG阳性，且抗NA-IgG阴性；②抗CA-IgM阴性，但抗CA- IgG阳性，且为低亲和力抗体；③双份血清抗CA- IgG滴度4倍以上升高；④外周血异型淋巴细胞比例≥10%。

1．3方法

1．3．1EBV抗体检测

静脉抽血2 mL，采用ELISA方法测定EBV4种抗体，包括：抗CA-IgM、抗NA-IgG、抗EA-IgM和抗CA-IgG。UNION-C免疫分析仪和试剂盒由深圳亚辉龙有限公司提供。

1．3．2EBV-DNA载量检测

静脉抽血1 mL，用EDTA-K2抗凝，采用Taq-Man荧光标记探针基因扩增技术进行测定。荧光探针序列为：FPEBV5′X-CCTCGGACAGCTCCTAAGAAGG-CACC-Y3′，26 bp。引物序列为：PQEBVF5′-AAGCCCAA-CACTCCACCAC-3′，19 bp；PQEBVR5′-CTGGTAGGACT-GGGCGAC-3′，18 bp。PCR扩增条件：将各反应管放入DA7600全自动荧光定量PCR仪按下列条件扩增：93℃2 min预变性；然后93℃45 s～55℃60 s，10个循环；最后93℃30 s～55℃45 s，30个循环。试剂购自中山大学达安基因股份有限公司，结果低于1．0×103拷贝／mL为阴性。

1．3．3异型淋巴细胞计数

采集病人血液，制作血片。瑞姬氏染色，奥林巴斯CX-41双目显微镜油浸分类异型淋巴细胞比例。异型淋巴细胞在白细胞分类中≥10%，判断为阳性，＜10%为阴性。

1．3．4统计学处理

采用SPSS 17．0统计学软件进行分析，3种实验室诊断方法和正常对照组间的阳性率比较用χ2检验（Pearson Chi-Square），3种实验室诊断方法敏感性比较采用χ2检验（McNemar Test）。

2　结果

2．1EBV 4种抗体检测结果

116例IM患儿EBV抗体阳性率如下：抗CAIgM阳性率最高，为84．48%（98／116），对照组阳性率为6．00%（3／50），两者比较差异具有统计学意义（χ2＝90．33，P＝2．01×10－21，P＜0．01）。抗CAIgM的特异性为94．00%（47／50），诊断符合率为87．35%［（98＋47）／（116＋50）］；抗NA-IgG阳性率为9．48%（11／116）；抗EA-IgM阳性率为49．14% （57／116）；抗CA-IgG阳性率为14．66%（17／116）。具体结果分布见表1。由于抗CA-IgM阳性一直是EBV感染IM的依据［4］，因此本文主要探讨抗CA-IgM与异型淋巴细胞、EBV-DNA的分析比较。

表1　EBV4种抗体检测结果不同模式的分布表Table 1　Distribution of the test results of 4 kinds of EBV antibody

2．2EBV-DNA载量检测结果

116例IM患儿中EBV-DNA的阳性率为85．34%（99／116），对照组阳性率为4．00%（2／50），两者比较差异具有统计学意义（χ2＝97．04，P＝6．79×10－23，P＜0．01）。EBV-DNA特异性为96．00%（48／50），诊断符合率为88．55%［（99＋48）／（116＋50）］。EBV-DNA阴性模式见图1，EBV-DNA阳性模式见图2。

2．3异型淋巴细胞检测结果

116例IM患儿中，异型淋巴细胞分类计数≥10%为39．66%（46／116）。对照组异型淋巴细胞分类计数阳性为0．00%（0／50），两者比较差异具有统计学意义（χ2＝27．43，P＝1．63×10－7，P＜0．01），异型淋巴细胞≥10%特异性为100．00%（50／50），诊断符合率为57．83%［（46＋50）／（116＋50）］。外周血正常淋巴细胞见图3，异型淋巴细胞见图4。

2．4抗CA-IgM和异型淋巴细胞结果对比

116例IM患儿中抗CA-IgM和异淋细胞联合检测，只要有1项阳性的有103例，阳性率为88．79%，2项同时阴性的有13例，阴性率为11．21%，见表2。可以认为这2个指标对IM检出率有明显差异，而2项同时检测对IM的诊断具有互补性，能提高IM的检出率。

2．5EBV-DNA和异型淋巴细胞结果对比

116例IM患儿中EBV-DNA和异型淋巴细胞联合检测，只要有一项阳性的有103例，阳性率为88．79%，2项同时阴性的有13例，阴性率为11．21%，见表3。可以认为这2个指标对IM检出率有明显差异，而2项同时检测对IM的诊断具有互补性，能提高IM的检出率。

表2　IM患儿抗CA-IgM和异型淋巴细胞检测结果Table 2　Results of CA-IgM and atypical lymphocytes

表3　IM患儿EBV-DNA和异型淋巴细胞检测结果Table 3　Test results of EBV DNA and atypical lymphocytes in children with IM

2．6EBV-DNA载量和抗CA-IgM结果对比

116例IM患儿中EBV-DNA载量和抗CAIgM联合检测，只要有一项阳性的有108例，阳性率为93．10%，2项同时阴性的有8例，阴性率为6．90%，见表4。可以认为这2个指标对IM检出率无明显差异。

2．73种方法两两并联检测的敏感性、特异性以及诊断符合率的比较

统计分析3种方法两两并联检测116例IM患儿和50例正常儿童的敏感性、特异性以及诊断符合率。3种方法两两并联检测的敏感性稍有提高，诊断符合率超过单独检测的任何一种方法，特异性稍有下降，但能满足临床需要。3种方法两两并联检测与单独检测敏感性、特异性以及诊断符合率的比较见表5。

表4　IM患儿EBV-DNA和抗CA-IgM检测结果Table 4　Test results of EBV DNA and CA-IgM in children with IM

3　讨论

外周血异型淋巴细胞是IM早期诊断的主要指标之一，成本低，取材易。但近半数学龄前儿童感染IM的异型淋巴细胞比例＜10%。关于IM患儿的异型淋巴细胞比值，文献报道不一。如本文116 例IM患儿中异型淋巴细胞比例≥10%的占39．66%，比常琴报道的89．73%［5］低，与郭勇报道的41．40%［6］相近。有报道该病的异型淋巴细胞一般在病后3天出现，第1周逐渐增多，第2周～第3周可达10%～35%，以后逐渐降低［7］。因此，对怀疑IM的患者，应多次进行外周血涂片异型淋巴细胞检查，以免漏检。据本实验室统计数据，巨细胞病毒、支原体、衣原体、肝炎、流感和风疹等感染患儿中可见异型淋巴细胞，但其百分比一般不超过10%。本文116例IM患儿通过与正常对照组比较，可见异型淋巴细胞在IM诊断中的敏感性较低，但特异性较高。

表5　3种方法两两并联检测与单独检测敏感性、特异性以及诊断符合率的比较Table 5　Comparison of sensitivity，specificity and diagnose accordance rate of combined detection and single detection of the 3 test methods

EB病毒抗体检测中主要包括抗CA-IgM、抗CA-IgG、抗EA-IgM和抗NA-IgG 4项。116例IM患儿中抗CA-IgM的阳性率为84．48%，比严海燕报道的91．43%［8］稍低。本文统计116例IM患儿可见抗CA-IgM的阳性率最高，其次分别是抗EAIgM、抗CA-IgG和抗NA-IgG。EB感染后由于各项抗体是先后出现的，本文中出现各种阳性组合可能在疾病的不同阶段检测有关。一般认为，抗CA-IgM在发病时滴度已经是最高，随着病程的推移而逐渐消失，抗CA-IgM阳性是IM急性期诊断的重要指标。抗CA-IgG在疾病恢复期继续存在，并终身持续，可用于流行病学调查。抗NA-IgG在3周～5周后开始出现，2个月～3个月后达高峰，滴度稍降低至较高水平终身保持，故无早期诊断价值。抗EA-IgM出现于原发感染的急性感染早期阶段，但有关该抗体的出现时间文献报道较少，有待进一步研究。EB病毒抗体血清学检查有助于动态反映感染后的各项抗体水平，并协助区分原发感染与既往感染，抗CA-IgM和抗CA-IgG浓度上升与原发感染有关。抗NA -IgG是既往感染的标志［4］。EBV感染的血清学反应复杂多样，有的病例抗CA-IgM产生延迟、有的持续缺失或长时间存在，这给IM的确诊带来一定难度。对于免疫功能低下或接受免疫球蛋白治疗的患儿，仅凭EBV特异性抗体往往难于诊断本病。

PCR方法则是检测病毒核酸，理论上可以更准确地反映EBV感染和病毒复制情况。实时荧光定量PCR技术，其扩增和产物检测一步完成，整个检测过程全封闭进行，避免了产物污染。且方法操作简便，重复性好，易标准化。在2010年版的《传染性单核细胞增多症临床路径》中已有提出EBV-DNA阳性可作为临床诊断依据之一［9］。血清学检查是诊断EBV感染的有效方法，但其只能作为病毒感染的指标，不能准确反应出体内EBV感染复制情况，而实时荧光定量PCR技术可以准确测定出病毒表达的丰度［10］。本文116例IM患儿EBV-DNA的阳性率为85．34%，与严海燕报道的87．14%［8］相近。经过治疗后，共有35例IM患儿通过检测EBV-DNA载量进行复查，其中26例从发病时的阳性变为阴性，9例结果虽仍为阳性，但载量较发病时已大大降低，十分接近于正常值。因此，定量检测外周血EBV-DNA载量能更好反应体内EBV的活动情况，在判断EBV感染的病情转归方面比血清学抗体检测更具价值。Pitetti等［11］研究显示IM患儿的外周血中EBV-DNA载量与临床表现的严重程度成正相关，这对患者病情严重程度的监测有重要意义。由于血清EBV阳性转化的健康人口部亦可不定时排病毒，因此，咽拭子或唾液标本不适合进行EBV-DNA检测［2］。

本文对116例IM患儿的3种实验室检测结果进行分析，可见抗CA-IgM和EBV-DNA载量的敏感性和特异性都较高。异型淋巴细胞的敏感性较低，但特异性较高，与郭勇认为异型淋巴细胞特异性不高［6］结论相反。抗CA-IgM和EBV-DNA载量进行对比，可以认为这2个指标对IM检出率无明显差异。血涂片进行异型淋巴细胞计数是诊断IM简便有效的筛查手段，但敏感性仅达39．66%，若能与抗CA-IgM或EBV-DNA载

量同时检测则能提高IM诊断的敏感性，可达88．79%。对116例IM患儿进行3种方法两两联合检测，可提高敏感性和诊断符合率，但特异性稍有下降。因此，EBV-DNA载量、抗CA-IgM和异型淋巴细胞计数两两联合检测可提高儿童IM的诊断率，对减少临床的漏诊和误诊有重要意义。

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•论著•

通讯作者：★邓坤仪，E-mail：13823969783＠139．com