4R22修饰的紫杉醇脂质体对肺癌细胞多药耐药的逆转作用

周毅　王赫　朱丽娜



4R22修饰的紫杉醇脂质体对肺癌细胞多药耐药的逆转作用

周毅1王赫2★朱丽娜1

［摘要］目的探索4R22修饰的紫杉醇脂质体逆转肺癌细胞（耐顺铂阿霉素细胞株A549／Adr）多药耐药的能力。方法薄膜分散法制备4R22修饰的紫杉醇脂质体（4R22-liposome-paclitaxel，4R22-LP-PTX）；通过马尔文粒径、电位仪测试脂质体的物理性能，通过流式细胞仪检测4R22-LP-PTX在普通A549和耐药的A549／Adr细胞中诱导凋亡的能力和转染能力；通过MTT法测试4R22-LP-PTX 对A549／Adr细胞的抑制率；通过流式细胞仪定量观察4R22-LP-PTX转入细胞中的荧光量。结果成功构建4R22-LP-PTX，平均粒径为106．5 nm，电位为3．12 mv，PDI为0．22，包封率85%。4R22-LPPTX能显著性的逆转耐药，有效的诱导A549／Adr细胞的凋亡，有效诱导A549／Adr细胞的增殖的抑制和有效的转染进入细胞表达，P＜0．05。结论成功构建的4R22-LP-PTX具有逆转人肺癌细胞A549／Adr耐药性的能力。

［关键词］4R22；紫杉醇脂质体；耐药肺癌细胞

作者单位：1．广州医科大学药学院，广东，广州511436

2．广州医科大学附属第二医院肿瘤科，广东，广州510250

化疗是肺癌的主要治疗手段之一，而多药耐药是导致肺癌化疗失败的主要原因［1－2］。大量文献已经报道肿瘤靶向给药系统能逆转耐药性从而诱导耐药细胞的凋亡［3］。肿瘤靶向给药系统是指借助载体、配体或抗体将药物选择性地浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的给药系统［2］。其中靶头修饰的纳米粒或者胶束能有效的逆转多药耐药性［4］，目前靶头主要集中在抗体或者多肽方面，与前者相比，小分子短肽有着体积小、易渗入组织和免疫原性小等优点。前期文献报道4R22是经过噬菌体库筛选后特异性的靶向非小细胞肺癌的小分子短肽，它具有和药物传递系统靶向肺癌的靶头功能［5］，但其是否能有效逆转多药耐药尚未定论。因此本研究以脂质体为载体，制备了4R22修饰的紫杉醇脂质体（4R22-liposome- paclitaxel，4R22-LP-PTX），检测其逆转多药耐药的作用。

1　材料与方法

1．1材料与仪器

Sizer Nano ZS 90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪（英国Malvern instruments Ltd）。大豆磷脂（上海太伟药业有限公司）；胆固醇（美国sigma公司）；DSPE-PEG 2000和DSPE-PEG 3500（美国A-vanti polar lipids）；香豆素-6（coumarin-6，coumarin，美国sigma公司）；DMEM高糖培养基和胎牛血清（美国GIBCO公司）；其余试剂为分析纯。人肺癌细胞A 549和顺铂（CDDP）诱导耐受的A549／Adr由本实验室提供。4R22（CSNIDARAC）由invitro公司合成。

1．2方法

1．2．14R22-LP-PTX的制备及其表征

参照文献方法［6－7］合成磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3500-4R22（DSPE-PEG 3500-4R22）。使用薄膜分散法制备4R22修饰脂质体。将处方量的紫杉醇，SPC，Cho，DSPE-PEG 3500-4R22，DSPE-PEG 2000，DSPE-PEG-OMe（保证总磷脂∶胆固醇＝73∶27（摩尔比），分别溶于氯仿，置50 mL茄形瓶中旋转蒸发成膜后，再置真空干燥器中过夜。加入2．5 mL PBS缓冲液（pH 7．4），置空气浴摇床中，37℃，180 r／min，20 min水化，水浴超声5 min脱膜，探头超声制备得到4R22-LP-PTX或者载香豆素-6脂质体（4R22-LP-coumarin）。

取适量制备得到的脂质体样品，用激光粒度仪测定其粒径和电位。采用葡萄糖凝胶柱色谱法分离脂质体与未包载的紫杉醇，将过柱后的脂质体采用甲醇破乳，用高效液相色谱法在228 nm检测紫杉醇含量。按照EE%＝W包／W投×100%计算包封率。W包：脂质体中包载的药物量。W投：制备脂质体的投药量。

1．2．2A549细胞对载coumarin脂质体的摄取

流式细胞仪（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）用于本次实验［8］。将对数生长期的细胞以5×105个／孔的密度接种于6孔板中，37℃培养24 h后，每孔加入coumarin，LP-coumarin和4R22-LP-coumarin 0．5 h，coumarin最终浓度为1．0 mol／L。相同的培养液作为对照组。孵育后，细胞用冰冷的PBS冲洗2次停止细胞的吸收。而后加入0．5% trypsin-EDTA，最后吸收的细胞量使用流式细胞仪计数。每个实验重复3次。

1．2．3荧光显微镜检测4R22-LP- rhodamine 123进入细胞内的研究［9］

简要如下：A549，A549／Adr细胞种在12孔板中，密度是10×104cells／孔。在5%CO2，37℃培养24 h后，细胞分别使用rhodamine 123，LP- rhodamine 123和4R22-LP- rhodamine 123作用2h，rhodamine 123在A549和A549／Adr细胞上的终浓度为10．0 mol／L。细胞用冰冷的PBS冲洗2次，再使用Hoechst 333342（10 mol／L）孵育30min后，冲洗细胞，最后用流式细胞仪检测。对照组使用相同条件处理。

1．2．4细胞毒性实验

培养A549和A549／Adr细胞并接种于96孔板中。孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入无菌过滤后的紫杉醇浓度分别为0．25 μg／mL、2．5 μg／mL、10 μg／mL、25 μg／mL的脂质体。将孔板移入37℃或4℃CO2孵箱中培养24 h后取出，每孔加入20 μL 5 mg／mL MTT溶液，再放回孵箱中继续孵育4 h，将孔板中液体倒出，每孔加入200 μL DMSO。37℃避光振摇15 min，用酶标仪在490 nm处测定各孔的光密度值。

1．2．5细胞凋亡实验

A549和A549／Adr细胞并接种于96孔板中。孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入无菌过滤后的Taxol，LP-PTX，4R22-LP-PTX，最终紫杉醇浓度为10 mol／L的脂质体。将孔板移入37℃或4℃CO2孵箱中培养24 h后取出，细胞混悬在缓冲液中，分别加入10 μL的Annexin V-FITC，室温孵育15 min，再加入5 μL PI，使用流式细胞仪分析，重复3次。

1．2．6统计学方法

正态计量数据以“x±s”表示，应用SPSS 21．0统计软件进行数据分析，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。P﹤0．05表示差异有统计学意义。

2　结果

2．14R22-LP-PTX的表征

制备得到的4R22-LP-PTX的粒径在106．5 nm左右，粒径分布系数PDI＜0．3，zeta电位为3 mV左右，紫杉醇的包封率为88．5%（见表1）。

表1　不同PTX纳米粒的物理特征（n＝3）Table 1　The physical characteristics of different PTX nanoparticles（n＝3）

图1显示体外评估纳米粒在包含10%FBS的PBS中释放PTX的累积量。结果显示，在2 h时，所有纳米粒释放PTX都少于20%。超过12 h，注射的PTX在体液中释放超过了98%，但注射剂Taxol不及10%。同时，LP-PTX和4R22-LP-PTX纳米粒释放PTX在12 h时分别为（32．3±2．23）%，（44．4±4．45）%和（53．4±5．54）%。与注射PTX相比，纳米粒释放PTX都出现了延迟的特点。然而，12 h后，所有纳米粒的释放曲线趋于平衡。

2．2A549细胞对脂质体的摄取

图2A显示的是肿瘤细胞对各种包载PTX制剂吸收后的流式结果。肿瘤细胞对脂质体的摄取量与流式细胞检测的荧光强度成正比，空白组、Taxol、LP-PTX和4R22-LP-PTX在A549细胞上的荧光强度分别为5．45．55±1．22，224．56±3．45， 510．34±12．33，778．98±12．34；而在A549／Adr中的强度分别为6．44±1．21，121．34±1．34，465．56± 13．23，790．65±12．45。靶向制剂在A549／Adr中的吸收略高于A549，提示靶向制剂能有效逆转耐药。

为了进一步观察细胞对不同组药物吸收的情况，使用rhodamine 123代替PTX制备并分组成rhodamine 123，LP-rhodamine 123纳米粒和4R22-LP-rhodamine 123纳米粒。图2B显示，亲水性的rhodamine 123能较好的分布在A549细胞中，导致了绿色荧光累积。当rhodamine 123被包入形成纳米粒时，与rhodamine 123和LP-rhodamine 123纳米粒相比，4R22-LP -rhodamine 123纳米粒在细胞浆中的重叠图像显示出更强的绿光。相反，rhodamine 123在A549／Adr中的荧光强度有限（图2C）。同时，我们发现，4R22-LP-rhodamine 123在A549／Adr细胞中的重叠的荧光强度接近在A549细胞中的（图2C）。该结果进一步证明了4R22-LP-rhodamine 123纳米粒能更有效的逆转耐药。

2．34R22-LP-PTX体外诱导耐药A549凋亡和细胞毒性

图3显示在空白组、taxol组、LP-PTX组和4R22-LP-PTX组作用中，A549和A549／Adr细胞凋亡的情况。细胞早期凋亡作为评价标准。空白组、Taxol组、LP-PTX组和4R22-LP-PTX组诱导A549细胞凋亡率分别是4．44%，10．43%，9．34%和11．65%，而诱导A549／Adr凋亡率分别为11．54%，17．65%，16．45%和23．46%。其中4R22-LP-PTX组诱导的A549／Adr相对凋亡率（4R22-LP-PTX组减掉PBS组后的凋亡值）与A549相比，差异不显著（P＝0．085）提示4R22-LP-PTX组能逆转耐药，诱导肺癌细胞凋亡。

图4显示了在不同组药物对A549（A）和A549／Adr（B）细胞的抑制性。和Taxol以及LPPTX相比，4R22-LP-PTX在1，5，10 mol／L的浓度下显著抑制了A549和A549／Adr细胞，P＜0．05。空靶向纳米粒展现较小的抑制性（＜1 mol／L），并且在高浓度10 μm对两细胞的抑制率小于30%。

3　讨论

MDR是导致恶性肿瘤化疗疗效差的主要原因之一［10］，寻找和开发新药或治疗策略成为当务之急。药物传递系统在传递抗癌药物到达肿瘤部位逆转耐药、提高疗效发挥着重要的功效，其中靶向基团修饰、且由生物降解材料构建的载体在药物传递系统研究中备受关注［11］。

4R22-LP-PTX纳米粒具有以下的特点：小粒径，高包封率和较低的阳性点位（图1）。小粒径和高包封率能使4R22-LP-PTX进入肿瘤组织，并且通过EPR效应在肿瘤组织中累积［12］。较低的阳性电位能使纳米粒进入肿瘤细胞后很好的与带有负电荷的线粒体结合［13］。

在药物释放实验中，释放期间的前2h，纳米粒中小量药物释放可以防止药物在传递过程中因泄漏带来的较大损失。即能保证药物释放后期在细胞、肿瘤中的药物累积达到较高的浓度。在肿瘤细胞毒性评价中，虽然Taxol的抑制能力在A549／Adr细胞中受到限制，但4R22-LP-PTX在A549和A549／Adr展现出强大的抑制率，而且两者的抑制率相近，提示4R22-LP-PTX有较强的逆转耐药的能力（图1）。

在凋亡评价中，4R22-LP-PTX同样在A549和A549／Adr表现出优秀的诱导细胞凋亡的能力（图3）。各种剂型诱导凋亡的效率相似或者有轻微不同。诱导A549／Adr细胞高凋亡率是由于未加药A549／Adr细胞高凋亡（与空白对照10．65± 0．43%，4R22-LP-PTX：24．05±0．40%）造成。而在A549细胞上的低凋亡率起源于未加药A549细胞低凋亡（与空白对照：4．63±0．27%相比，4R22-LPPTX：11．33±0．58%）。在未加药A549／Adr中的高凋亡是由于CDDP诱导并保持CDDP耐受A549的培养中造成的。从结果，我们可以清晰的看出4R22-LP-PTX诱导耐药的A549／Adr细胞凋亡的效果与普通的A549无显著性差异，进一步证实了4R22-LP-PTX逆转耐药、诱导肿瘤细胞的凋亡。

通过流式细胞仪检测，我们清晰观察到rhodamine 123进入细胞浆产生的绿光的情况；同时借助Hoechst 33342染核产生的蓝光，观察脂质体作用到核，最后诱导细胞死亡的情况。与普通A549细胞相比，普通rhodamine 123进入A549／Adr细胞核的量有限，产生较弱的蓝光；而4R22-LP- rhodamine 123带来显著的蓝光（重叠部分）。重要的是，与A549细胞相比，4R22-LP-rhodamine 123转入A549／Adr细胞率无显著性差异，提示4R22-LP- rhodamine 123有较好的逆转耐药功能。其机制可能是靶头4R22修饰的脂质体运载了大量rhodamine 123在A549细胞的聚集、内吞并且作用细胞核。

综上所述，4R22-LP-PTX能显著性的逆转耐药，并有效的诱导A549／Adr细胞的凋亡，该制剂可成为临床治疗耐药的手段的选择。

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Overcoming the drug resistance in lung cancer cells with 4R22-modified paclitaxel liposome treatment

ZHOU Yi1, WANG He2★, ZHU Lina1
(1. College of Pharmaceutics Science, Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 511436; 2. Department of Oncology, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 510260)

[ABSTRACT]ObjectiveTo study how to regain the sensitivity to the drugs in the drug resistant lung cancer cells with 4R22 modified paclitaxel liposome (4R22-LP-PTX) treatment. Methods4R22-LPPTX was prepared by film dispersion method. The biophysical properties of 4R22-LP-PTX were tested by Malvin size and potentiometer. The apoptosis of lung cancer cells (A549 cells and A549/Adr cells [resistant cell line]) and carrying capacity induced by 4R22-LP-PTX were evaluated by flow cytometry. Inhibition rates of 4R22-LP-PTX on A549/Adr cells were determined by MTT method, and fluorescence of 4R22-LP-PTX penetrated in the cells was quantified by flow cytometry.Results4R22-LP-PTX was successfully constructed. The average particle size, potential, PDI, and coating rate were 106.5 nm, 3.12 mv, 0.22, and 85%, respectively. 4R22-LP-PTX could be effectively transfected into A549/Adr cells, significantly overcome the drug resistance, induce apoptosis of A549/Adr cells, and thus inhibit the proliferation of A549/Adr cells, compared with A549 cell (P<0.05). Conclusion4R22-LP-PTX can be successfully constructed, transfected into the drug resistant human lung cancer cells, and thus overcome the drug resistance of the cancer cells.

[KEY WORDS]4R22; Paclitaxel liposome; Drug resistant lung cancer cells

通讯作者：★王赫，E-mail：wanghe97＠hotmail．com

基金项目：国家自然科学基金（81402023）