低密度粒细胞在自身免疫性疾病中的病理生理作用

周丽彬　周剑涛　丁海峰



低密度粒细胞在自身免疫性疾病中的病理生理作用

周丽彬1周剑涛2★丁海峰2

［摘要］疾病期增强活化异常的中性粒细胞可能导致组织损伤和异常免疫应答。最近报道了一种中性粒细胞亚群，即从系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者的外周血单核细胞部分分离出的低密度粒细胞（low-density granulocytes，LDGs）。LDGs的表型和功能不同于循环中性粒细胞，其具有促炎性和致病性功能，包括内皮细胞毒性和合成干扰素-I的能力。此外，LDGs容易形成中性粒细胞胞外诱捕网（low-density granulocytes，NETs），NETs促进自身抗原外显与器官损伤。阐明LDGs的的致病作用，有可能为SLE和其他自身免疫性疾病设计新的治疗策略。

［关键词］低密度粒细胞；中性粒细胞；自身免疫性疾病；中性粒细胞胞外诱捕网；I型干扰素

作者单位：1．湖北省罗田县皮肤病医院检验科，湖北，罗田438600

2．黄冈职业技术学院医药卫生学院，湖北，黄冈438000

注：周丽彬和周剑涛为并列第一作者

1986年，Hacbarth等［1］首先采用Ficoll-Hypaque密度梯度制备技术，从系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）成人患者的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）制备物中发现“低浮力密度粒细胞”（low buoyant density granulocytes），这种低浮力密度粒细胞与SLE病情活动性相关。2003年，Bennett等［2］对SLE小儿患者的PBMCs进行微阵列分析，发现其高度表达中性粒细胞特异性基因，并认为该现象是患者PBMCs部分所存在的未成熟中性粒细胞表达的结果。2008年，Nakou等［3］分析SLE成人患者骨髓基因微阵列，证实上调粒细胞生成基因与疾病活动性有关，其中几个上调基因出现在中性粒细胞早期发育阶段。2010年，Denny等［4］采用负性选择技术从SLE患者PBMCs得到高纯化的低密度中性粒细胞，并将此称之为“低密度粒细胞”（low density granulocytes，LDGs）。本文围绕SLE阐述LDGs的形态学与病理生理特征。

1　从PBMCs中分辨LDGs

研究者最初在SLE成人患者血液中证实LDGs的存在［1］。目前已知人、鼠和猪的血液中能分离出LDGs［5］。基于单核细胞和中性粒细胞表达标记物分化抗原簇（cluster of differentiation，CD）14与CD15的差异，采用流式细胞分析技术［4］，可从PBMCs中分辨单核细胞和LDGs。单核细胞为CD14＋／CD15lo（“lo”表示“低”），而LDGs为CD14lo／CD15＋。有学者通过CD14／CD15标志物，检测了SLE患者PBMCs中LDGs水平［4］。65份SLE样本中，12份（19%，12／65）SLE患者PBMCs的LDGs 占PBMCs总数的25%以上，并发现LDGs水平升高的SLE患者伴有皮肤并发症（包括血管炎）和／或滑膜炎。相比之下，其PBMCs谱与健康对照组相当的SLE患者没有观察到这些临床并发症。不仅SLE患者的PBMCs中能分离出CD15＋中性粒细胞，在创伤［6］、人类免疫缺陷病毒感染［7］、内脏型利什曼虫病［8］、类风湿关节炎［9］、牛皮癣［10］、癌症［11］和正常妊娠期［12］的PBMCs中也能分离出CD15＋中性粒细胞。

除了CD14／CD15标志物，还可以基于单核细胞表达主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）和辅刺激分子CD86，而不表达膜肽酶CD10进一步分辨出LDGs。相比之下，LDGs表达CD10，但缺乏MHCⅡ和CD86。分析CD86／CD16显示几种亚群。大多数健康对照单核细胞显示CD86＋CD16－静止表型，SLE单核细胞显示CD86＋CD16＋激活表型，而LDGs显示CD16hi／CD86－（“hi”表示“高”）［4］。

2　LDGs的形态学特征

独特的多形核与粒细胞颗粒是中性粒细胞的2个典型形态学特征。中性粒细胞在发育成熟期获得细胞颗粒物，存在于细胞颗粒内的各种蛋白质合成时限不同，根据细胞分化的特定阶段形成具有不同肽类的不同细胞颗粒。在原始粒细胞发育至核分叶阶段，中性粒细胞的细胞颗粒异质性增加。正常情况下，未端分化的中性粒细胞才从骨髓释放。

在Ficoll密度梯度分离程序中，成熟中性粒细胞与红细胞位于同一沉降区，而LDGs则位于PMBCs沉降区。采用鉴别染色法观察LDGs的细胞核形态［2］，显示出分叶状、带状或者中幼粒细胞样细胞特征。使用透射电子显微镜观察纯化的SLE-LDG超微结构特征［5］，结果显示LDGs相对于正常密度中性粒细胞分叶核更少，清晰地显现出稠密的异染色质与去致密的常染色质，在其细胞质中可识别出各种细胞颗粒。超微结构分析，细胞核形态表现为更大程度的未成熟状态，如带状／幼稚形。这些观察证明：（1）LDGs并不是已释放出颗粒的激活态中性粒细胞的亚群；（2）LDGs的细胞质未经历液泡化或者细胞凋亡。LDGs的发育状态及其形成机制目前尚不十分清楚。

3　LDGs的病理生理作用

3．1LDGs的促炎作用

中性粒细胞作为第一线免疫细胞，除了吞噬作用和脱粒作用之外，还具有另一种抗微生物机制，即释放细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）用以捕获与杀灭入侵的病原体。NETs是中性粒细胞DNA与组蛋白、细胞质内颗粒（源性）蛋白质形成的胞外网络结构，形成NETs的过程是一种细胞死亡通路［13］。中性粒细胞释放NETs的死亡通路被描述为“NETosis”。Villanueva报道［14］，SLE患者的致敏中性粒细胞形成NETs，特别是LDGs形成NETs的能力显著增强。在感染部位募集的中性粒细胞通过脱粒作用和／或NETosis释放出蛋白酶，以及合成促炎细胞因子和类花生酸类。中性粒细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子作用下有能力合成各种炎性因子mRNAs，包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA。LDGs分泌TNF-α的水平高于正常密度中性粒细胞［4］。在未激活状态，LDGs、SLE正常密度中性粒细胞（SLE组）与正常密度中性粒细胞对照组（Control组）的TNF-α实验测定值［平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）±标准平均误差（standard error of mean，SEM）］分别为70±25、39．3±80和38±0．1。在激活状态，LDGs、SLE组与Control组的TNF-α实验测定值（MFI±SEM）分别为2688±960、62．6±18和50±0．2。由此可知，LDGs有可能代表SLE疾病状态TNF-α的来源之一。

LDGs合成白介素（interleukin，IL）-8和IL-6的水平高于自体狼疮中性粒细胞和对照中性粒细胞［4］，例如，在未激活状态，LDGs、SLE组与Control组的IL-8实验测定值（MFI±SEM）分别为33±13．2、29± 9．2和27±11．7。在激活状态，LDGs、SLE组与Control组的IL-8实验测定值（MFI±SEM）分别为42± 10．9、40±3．46和34±7。这些炎性细胞因子增高可能导致SLE炎症反应和组织损伤增强。

Ⅰ型干扰素（type I interferons，IFN-I）是有效抗病毒和抗细胞增殖的细胞因子。持续产生IFN-I 是SLE患者的特征之一［15］。SLE患者长期固有地激活类浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）分泌IFN-I是引发自身免疫的关键早期事件［16］。IFN-I可以促进成熟中性粒细胞产生NETs，这可能会导致一个自我实现的循环，即细胞因子激活粒细胞NETosis而死亡，反过来又导致pDCs合成更多的IFN-I。此外，LDGs形成NETs有能力在狼疮巨噬细胞激活Nod样受体蛋白3 （Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性体，增加IL-1β和IL-18产生，依次进一步促进炎性反应和NETosis，形成潜在的恶性炎性循环［17］。

3．2LDGs合成IFN-I与内皮细胞损伤

研究表明［18］，IFN-I在SLE的内皮细胞损伤，进而导致动脉粥样硬化形成的病理过程中发挥重要作用。SLE患者的内皮细胞损伤和修复严重失衡，其特点是内皮细胞凋亡加快，以及血管生成的关键细胞，如骨髓内皮祖细胞（bone marrow-derived endothelial progenitor cells，EPCs）与髓循环血管生成细胞（myeloid circulating angiogenic cells，CACs）的表型和功能异常。当去除狼疮EPCs／CACs中IFN-I信号传导，可导致正常表型恢复，表明IFN-I对降低血管修复功能具有重要作用。研究报道［19］，使用细胞形成检测法计数EPCs，SLE患者的EPC细胞形成单位较对照组显著降低，对照组EPC细胞形成单位中位数为28．5／mL外周血（四分位距14．7～47．3），SLE患者为5．7／mL外周血（四分位距1．9～12．8），而对于IFN-I水平升高的SLE患者EPCs减少更加显著，进一步证实IFN-I水平升高引起EPCs减少与SLE患者的内皮功能障碍和心血管风险增加相关。Denny等［4］指出，培养的LDGs合成足够量IFN-I，干扰内皮祖细胞分化为成熟内皮细胞的能力，这一现象与SLE患者过早地形成动脉粥样硬化有关。

LDGs对内皮细胞的细胞毒性效应似乎与LDGs形成NETs的能力有关，因为当有核酸酶存在，分解NETs时，血管细胞死亡现象消失［14］。更高数量的LDGs可能与狼疮并发症有关，如皮肤病和血管炎［4］。此外，在伴有皮肤病和肾脏并发症的SLE患者的皮肤和肾脏中，观察到诱捕网样中性粒细胞的浸润［14］。然而，这些细胞是否代表LDGs或正常密度中性粒细胞尚不清楚，目前，在组织水平尚没有可以区分这两类中性粒细胞的细胞标记物。

4　展望

LDGs代表激活中性粒细胞的一种亚群，具有与成熟的正常密度的中性粒细胞不同的表型和功能。流式细胞术和电镜技术已证明LDGs存在于SLE患者外周血中，并与其病理过程相关。未来的研究应探讨其他的自身免疫性疾病是否也存在LDGs，以及LDGs是否与这些疾病和器官损伤的发生有关。进一步系统地研究评估LDGs的起源、分化成熟状态及其病理生理作用，有可能为SLE和其他自身免疫性疾病设计新的治疗策略。

参考文献

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Pathophysiological effect of low-density granulocytes in autoimmune diseases

ZHOU Libin1, ZHOU Jiantao2★, DING Haifeng2
(1. Laboratory Department of Skin Disease Hospital of Luotian County, Luotian, Hubei, China, 438600; 2.Medical and Health College of Huanggang Polytechnic University, Huanggang, Hubei, China, 438000)

[ABSTRACT]Tissue damage and potential aberrant immune responses could be caused by increased activation of abnormal neutrophils during the progression of autoimmune diseases．Recent studies have demonstrated a distinct subset of neutrophils isolated from the fraction of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in the patients with systemic lupus erythematosus（SLE），which has been defined as low-density granulocytes（LDGs）．Compared with the circulating neutrophils in healthy individuals，LDGs show distinct phenotype and abnormal functions．They demonstrate proinflammatory activity and pathogenic effects，including injury to endothelial cells and enhanced capability to synthesize type I interferons（IFN-I）．Moreover，LDGs facilitate the formation of neutrophil extracellular traps（NETs）which plays an important role in promoting autoantigen externalization and resulting in organ damage．With elucidation of the pathogenicity of LDGs，novel therapeutic modalities may be designed for the treatment of SLE and other autoimmune diseases in the near future．

[KEY WORDS]Low-density granulocytes; Neutrophil; Autoimmune diseases; Neutrophil extracellular traps; Type I interferon

通讯作者：★周剑涛，E-mail：hgwx8＠163．com