采用ERIC-PCR与PFGE分析鲍曼不动杆菌基因型和同源性并对比方法学差异

闻海丰　冯忠军　秦瑾　于文静



采用ERIC-PCR与PFGE分析鲍曼不动杆菌基因型和同源性并对比方法学差异

闻海丰1★冯忠军1秦瑾2于文静3

［摘要］目的比较脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）与肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERICPCR）检测鲍曼不动杆菌同源性的结果差异。方法分别采用PFGE和ERIC-PCR对我院院内分离的43株鲍曼不动杆菌进行分型检测。结果43株鲍曼不动杆菌通过PFGE分型得出：A型22株、B型10株、C型3株、D型4株、E型2株、F型1株、G型1株；通过ERIC-PCR得出7种型别：Ⅰ型22株、Ⅱ型10株、Ⅲ型3株、Ⅳ型2株、V型3株、Ⅵ型1株、Ⅶ型2株。2种方法结果相符率为76．8%。我院鲍曼不动杆菌存在克隆株传播。结论ERIC-PCR操作简便、结果可靠，与PFGE结果一致性高，2种分型方法均适合作为医院进行病原菌流行病学调查的分型检测手段。

［关键词］脉冲场凝胶电泳；肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链式反应；鲍曼不动杆菌

作者单位：1．河北医科大学第三医院检验科，河北，石家庄050051

2．河北医科大学第三医院感控科，河北，石家庄050051

3．河北省儿童医院检验科，河北，石家庄050031

Comparison between PFGE and ERIC-PCR for genotyping and homologous analysis of Acinetobacter baumannii

WEN Haifeng1★, FENG Zhongjun1, QIN Jin2, YU Wenjing3
(1. Department of Laboratory Medicine, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei, China, 050051; 2. Department of Noscomial Infection Control, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei, China, 050051; 3. Department of Laboratory Medicine, Children's Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang, Hebei, China, 050031)

［ABSTRACT］ObjectiveTo compare the pulsed field gel electrophoresis (PFGE) with the enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR) in genotyping and homologous analysis of Acinetobacter baumannii.MethodsPFGE and ERIC-PCR were used to test the genotypes of 43 isolates of Acinetobacter baumannii, respectively. Results43 isolates of Acinetobacter baumannii were classified into 7 genotypes by PFGE, including genotype A in 22 samples, genotype B in 10, genotype C in 3, genotype D in 4, genotype E in 2, genotype F in 1 and genotype G in 1. Correspondingly, they were categorized by using ERIC-PCR method as following 7 genotypes: typeⅠin 22, typeⅡin 10, type Ⅲin 3, typeⅣin 2, typeⅤin 3, typeⅥin 1 and typeⅦin the remaining 2 samples. The correlation coefficient between the two methods was 76.8%. It was suggested that there were spreads of clonal Acinetobacter baumannii among the patients in our hospital.ConclusionERIC-PCR is a simple and reliable method of bacterial genotyping. The data are highly correlated with the results acquired by PFGE. Bothmethods are suitable for applying in the epidemiological investigation of nosocomial infections.

［KEY WORDS］Pulsed field gel electrophoresis (PFGE); Enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction(ERIC-PCR); Acinetobacter baumannii

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，ABA）为不动杆菌属中最常见的一种需氧、非发酵、革兰阴性球杆菌，广泛分布于自然界的水及土壤中，正常人体的皮肤、呼吸道和尿道也有存在。由于近年鲍曼不动杆菌所引起的医院感染暴发流行明显增多［1］，耐药性日益增强，已经得到临床的普遍重视。检测医院内鲍曼不动杆菌基因同源性是进行院内感染流行病学调查的重要手段，具有十分重要的流行病学意义。本研究分别采用脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）和肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR）2种方法对医院内鲍曼不动杆菌进行同源性检测，并对比分析2种检测方法的可靠性及一致性，为今后开展相关工作提供参考，现报告如下。

1　材料与方法

1．1标本来源

2014年3月至2014年11月我院住院病人肺部感染患者送检细菌培养标本经过分离培养得到菌株43株，均为血培养和痰培养标本，所有菌株均经过API鉴定系统鉴定。

1．2主要试剂

溶菌酶（0．1 mg／mL，德国默克Merk公司），蛋白酶K（0．5 mg／mL，德国默克Merk公司），苯甲基磺酰氟（德国默克Merk公司），限制性内切酶ApaI（美国NEB公司），Lambda Ladder PFG Marker（美国Bio-Rad公司），脉冲场级琼脂糖（美国Bio-Rad公司），肠杆菌科和其它非苛氧革兰阴性鉴定试剂盒ID32E鉴定试剂卡（法国生物梅里埃中国有限公司），5×TBE溶液（上海双螺旋生物科技有限公司），10×TAE溶液（上海双螺旋生物科技有限公司），ERIC-PCR引物（北京赛百盛基因技术有限公司），细菌基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），PCR绿色体系（加拿大富酶泰斯MBI Fermentas公司），GoldViewⅠ（北京索莱宝科技有限公司），琼脂糖（北京赛百盛基因技术有限公司），DNA Marker DL2000（北京康为世纪生物科技有限公司）。

1．3主要仪器

Genepath脉冲电泳仪Ⅱ型（美国Bio-Rad公司），凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司），API7300型荧光定量PCR检测仪（美国生物应用公司），BGPower 600通用电泳仪（北京百晶生物技术有限公司），WD-9403F紫外仪（北京六一生物科技有限公司），TGL-16G高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1．4PFGE试验方法

1．4．1细菌的包埋

取试验菌落配制3麦氏浓度菌悬液1 mL，12 000 rpm离心2 min，弃上清，取0．05 mL细菌悬浮缓冲液，重新悬浮沉淀，平衡至50℃；加入50℃等体积2%Cleancut琼脂糖凝胶，充分混合并灌注模具，4℃冰箱中凝固10 min～15 min。

1．4．2细菌的裂解

向胶块加入0．3 mL溶菌酶稀释液，37℃孵育2 h。无菌水清洗胶块2次。加入0．3 mL蛋白酶K稀释液，50℃孵育12 h，吸出蛋白酶K稀释液，加清洗缓冲液充分清洗后加入1 mL浓度为1 mmol／L的苯甲基磺酰氟灭活剩余的蛋白酶K，室温震荡1 h后，重复清洗2次。

1．4．3限制性酶切

加入80 U限制性内切酶ApaI和0．2 mL酶切缓冲液，37℃孵育过夜后清洗胶块。

1．4．4加样和电泳

用0．5×TBE缓冲液配制100 mL 1%的PFGE级琼脂糖，制胶并小心上样。在电泳槽中加入2 000 mL 0．5×TBE缓冲液，将凝胶放入电泳槽中，调节程序为起始转换时间为1 s，最终转换时间为17 s，电场强度6 V／cm，电场夹角120°，电泳时间18．5 h，非线性。

1．4．5结果图像采集与分析

使用凝胶成像仪采集电泳结果图像并进行结果分析：把泳道中的条带按照出现与否进行二进制积分，依据Dice系数（F）比较各菌株之间的相似性，F＝2Nxy／（Nx＋Ny）（Nxy：X和Y分离株之间共同拥有的条带数目；Nx：X分离株的总的条带数目；Ny：Y分离株之间总的条带数目）。依据国外研究［2］报道，实验以相似性系数80%为分型界值，相似度＝1为同一菌株，相似度≥80%为同一亚型，相似度＜80%为不同基因型。

1．5ERIC-PCR试验方法

1．5．1细菌DNA模板的制备

将1 mL 0．5麦氏浓度菌悬液10 000 rpm离心1 min，向沉淀中加入180 μL Buffer GTL，混匀。加入20 μL蛋白酶K，混匀，56℃孵育，直至菌体完全裂解。加入200 μL Buffer GL，混匀。加200 μL无水乙醇，震荡混匀。将所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，10 000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加500 μL Buffer GW1，10 000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加500 μL Buffer GW2，10 000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，并重复一次。12 000 rpm离心2 min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温5 min，彻底晾干。将吸附柱置于一个新的离心管中。向吸附柱的中间部位悬空加入100 μL Buffer GE，室温放置5 min，10 000 rpm离心1 min，收集DNA溶液，－20℃保存DNA。

1．5．2ERIC-PCR引物制备

根据文献［3］合成ERIC-PCR引物：ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′—AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3，稀释引物至浓度为10 μmol／L备用。

1．5．3ERIC-PCR反应体系

反应体系总体积为50 μL：ERIC1，ERIC2各2 μL，DNA模板5 μL，PCR反应绿色体系Green PCR Master Mix 25 μL，PCR超纯水16 μL。

1．5．4PCR反应条件

95℃预变性1 min；95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行35个循环；72℃延伸10 min。

1．5．5PCR扩增产物电泳

以2%琼脂糖制备电泳凝胶胶块，以1×TAE溶液为电泳缓冲液，取5 μL扩增产物，电泳电压110 V，电泳时间为45 min。

1．6统计学方法

根据2种分型方法的分型结果差异，通过SPSS 19．0进行四格表卡方检验。

2　结果

2．1应用PFGE对鲍曼不动杆菌分型结果

43株鲍曼不动杆菌经提取基因组DNA后进行脉冲场凝胶电泳，形成碱基条带在10 bp～300 bp之间的指纹图谱。通过分析PFGE电泳图谱，43株鲍曼不动杆菌主要分为7型：A型（22株）、B型（10株）、C型（3株）D型（4株）、E型（2株）、F型（1株）、G型（1株），其中A型又被细分为A1、A2 共2种亚型，结果见图1。

2．2应用ERIC-PCR对鲍曼不动杆菌分型结果

43株鲍曼不动杆菌经过ERIC-PCR后，形成5条左右的碱基条带，条带长度在100 bp～2 000 bp之间，通过分析，菌株可被分为通过ERIC-PCR分型，被分为Ⅰ型（22株），Ⅱ型（10株），Ⅲ型（3株），Ⅳ型（2株），Ⅴ型（3株），Ⅵ型（1株），Ⅶ型（2株）共7种型别，结果见图2。

2．3应用PFGE和ERIC-PCR分型结果对比分析

43株鲍曼不动杆菌通过PFGE和ERIC-PCR分型后，结果基本相互吻合，但是仍然存在少数标本的分型结果差异，总体上结果一致率为76．8%，具体见图3。43株鲍曼不动杆菌应用PFGE与ERIC-PCR方法的分型结果以散点图的分布形式表示，可见在A型（PFGE）与Ⅴ、Ⅵ型（ERICPCR），D型（PFGE）与Ⅰ型（ERIC-PCR）等处存在分型结果差异。

2．4统计学分析

比较PFGE和ERIC-PCR分型结果，以PFGE分型结果为基础，并结合ERIC-PCR结果和菌株耐药谱结果进行校正，以此结果为标准对比2种分型方法的分型结果，进行四格表卡方检验，见表1。43株医院分离鲍曼不动杆菌PFGE结果中42株结果一致，1株不一致；ERIC-PCR分型结果中37株一致，6株不一致。经卡方检验P＞0．05，可以认为2种分型方法没有显著差别。

表1　对2种分型方法的分型结果进行卡方检验Table 1　The Chi square test results of two genotyping methods

3　讨论

鲍曼不动杆菌是不动杆菌属中最主要的菌株之一，由于鲍曼不动杆菌具有耐干燥［4］，生存能力强，有较强的消毒剂抗性［5］，对多种抗生素耐药严重［6］，所以在医院内有很强的生存力，是近年来引起医院暴发流行的重要病原菌之一。对医院内鲍曼不动杆菌进行菌株分型，检测其同源性，是对鲍曼不动杆菌院内感染进行流行病学调查，有效控制鲍曼不动杆菌院内感染暴发流行的重要手段，具有十分重要的意义。研究发现［7］，同一基因型的不同菌株，其抗生素耐药谱是可能并经常存在不同程度的差别，进一步说明了在对菌株进行流行病学研究时应用基因分型取代传统应用耐药谱分型的必要性。近年来国内外最常用的病原菌分子生物学水平的分型方法主要为PFGE［8］分型法和ERIC-PCR［3］分型法。2种分型方法在方法原理上存在较大的差别：PFGE通过对细菌的全部基因组DNA进行消化切割，产物在动态变换角度的电场中电泳，依据消化产物的大小及构象而分离出指纹图谱，依此作为分型的依据；而ERIC-PCR是利用肠杆菌科基因的高度保守并且重复的序列设计引物，通过PCR扩增产生不同的指纹图谱，进行基因分型。PFGE分型指纹图谱图像分辨力强，结果辨识度和重复性好，操作标准化，并且有成熟分型结果数据库，PFGE被国内外分子流行病学者广泛认同，被认为是病原菌分子生物分型的“金标准”方法［9］。ERIC基因虽然是保守序列，但是细菌基因组DNA中依然可能出现该基因不完整、缺失、突变等情况发生，甚至会导致试验变成一种随机扩增实验［10］，又由于ERIC-PCR扩增产物长度不能确定，也会在电泳的时候出现条带缺失，产量低的条带显像模糊或条带分辨不清晰等情况，所以PFGE和ERIC-PCR 2种分型方法结果可能会存在差异。近年来的多项研究报告了对PFGE与ERICPCR 2种分型方法应用在多个种属间的病原菌分型和分型结果对比［11－15］，本研究也平行对比了2种分型方法在鲍曼不动杆菌分型结果。

本研究对我院临床分离43株鲍曼不动杆菌采用PFGE和ERIC-PCR2种方法进行基因分型，均分出7种型别。分型结果显示，通过PFGE分型的B型菌株与通过ERIC-PCR分型的Ⅱ型菌株全部吻合对应，通过PFGE分型的C型菌株与通过ERICPCR分型的Ⅲ型菌株全部吻合对应，通过PFGE分型的E型菌株与通过ERIC-PCR分型的Ⅶ型菌株全部吻合对应，实验中有15株鲍曼不动杆菌通过PFGE和ERIC-PCR 2种分型方法的结果高度一致，占总分型菌株的34．9%。通过PFGE分型的所有A1菌株和所有D型菌株共同对应ERIC-PCR分型的所有22株Ⅰ型菌株，2种分型方法的分型结果基本一致。而实验中有10株鲍曼不动杆菌通过2种分型方法得到的分型结果存在明显差异。实验结果显示，2种分型方法所得到的大多数菌株的分型结果可以完全对应，少量菌株的分型结果呈现为多种PFGE型别对应一种ERIC-PCR型别。实验结果显示2种分型方法在区分主要型别方面一致性非常高，分型结果总体一致率达到76．8%，只是在非主要型别和亚型的区分上存在一定差异，通过统计学卡方检验，P＞0．05，可以认为2种分型方法的分型结果没有显著差异，与国内外相关研究报道相一致。Merzougui等［12］研究认为PFGE具有较好的分型辨别力，但PFGE分型周期长，ERIC-PCR可以作为其很好辅助和补充分型方法，孙晶等［14］研究同样显示PFGE和ERIC-PCR方法的病原微生物分型结果表现出较好的一致性。但国外也有研究报道PFGE与ERIC-PCR的分型结果缺少关联性［15］，ERIC-PCR是基于肠杆菌科基因间保守重复序列的分型技术，该技术对于乳球菌属等菌属分型的型别辨识度低可能是其中的重要原因。本实验研究对比2种分型结果可以发现：通过PFGE分型方法对鲍曼不动杆菌分型时，对某些型别的分辨率要优于ERIC-PCR方法，PFGE方法对型别的辨识度更高，此结论也与国外相关研究结论相一致［13，15］。

通过PFGE［16］和ERIC-PCR［17］都可以很好地对我院分离鲍曼不动杆菌进行分型和菌株同源性分析。PFGE对仪器设备要求较高，试剂耗材较贵，操作复杂、时间周期长，因此PFGE在国内开展并不十分广泛。ERIC-PCR方法简单、快速，对仪器设备和试剂等要求相对较低，更方便医院广泛开展。总之，PFGE和ERIC-PCR方法都可以较好的完成对鲍曼不动杆菌的分型和同源性分析，达到有效的控制鲍曼不动杆菌在医院内的暴发流行的目的。

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•论著•

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通讯作者：★闻海丰，E-mail：50559419＠qq．com

基金项目：河北省卫生厅重点科技研究计划（20110099）