CD-DST技术：为肿瘤细胞量“身”定药

徐伟　李文迪　邓天颖　张志高　杜红延



CD-DST技术：为肿瘤细胞量“身”定药

徐伟李文迪邓天颖张志高杜红延★

［摘要］肿瘤原代细胞三维立体培养法药敏检测技术（collagen gel droplet-embedded culture drug sensitivity test，CD-DST）是一种先进的体外化疗药物敏感性检测方法，相对于其它方法有着无可比拟的优势，比如细胞用量少、简便快速等。自该法建立以来，大量基于此平台的临床研究便陆续开展起来，主要针对一些常见的恶性肿瘤，如大肠癌、乳腺癌等。大量研究证实，CD-DST技术的检测结果与临床治疗效果的拟合程度很高，应用该方法模拟的化疗方案，患者都取得了较好的疗效。CD-DST对于建立肿瘤患者的个体化治疗方案有着重要的指导意义，相信随着技术的不断发展以及更广泛的应用，会在个体化治疗中得到更广泛的应用。本文综述了CD-DST技术的建立及研究进展，有望为该技术的发展提供新的思路，为肿瘤患者提供新的治疗手段。

［关键词］体外药敏检测；肿瘤；CD-DST；化疗

作者单位：南方医科大学生物技术学院，广东，广州510515

注：徐伟和李文迪为并列第一作者

随着社会经济和医疗卫生的发展，健康已成为人们越来越关心的问题。浙江大学医学院巴德年院士提出“3P”医学理念，被誉为21世纪医学发展的新方向。“3P”医学指的是预防医学（preventive）、预测医学（predictable）和个体化医学（personal）。其中“个体化”在慢性疾病治疗中的重要性和必要性日益提升，特别是在肿瘤的诊疗方面。化疗是治疗肿瘤的主要手段之一，但由于肿瘤的个体化差异，同一化疗手段对不同肿瘤患者甚至不同肿瘤的疗效差异较大，盲目的使用化疗药物不但会给患者带来不必要的经济损失，甚至会导致治疗失败。显而易见，在患者进行化疗前，利用体外检测技术检测患者肿瘤对化疗药物的敏感性相当重要。传统的体外检测药敏性的方法有很多，比如琥珀脱氢酶抑制试验、四唑蓝比色法、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生物荧光体外药敏检测法及立体组织培养药物检测试验等，它们在一定程度上解决了部分肿瘤个体化治疗的问题，但限制条件多，检测效果并不理想。在此研究背景下，肿瘤原代细胞三维立体培养法药敏检测技术（collagen gel droplet-embedded culture drug sensitivity test，CD-DST）应运而生。

最初有报道称在胶原培养基上进行肝细胞单层培养可以成功维持细胞的形态与功能［1］。随后Yang［2］等研究者便尝试将小鼠乳腺癌上皮细胞种植于胶原培养基上，他们发现在胶原形成的三维立体结构中可以提供类似体内细胞的生长环境。经历了近20年的试验和探索，最终在1997年，Kobayashi［3］等人在已有的经验基础上正式建立了一种新型体外药敏检测技术——CD-DST技术。CD-DST技术一出现便以其培养成功率高、细胞需量少、所培养细胞的生物学特性与体内相似、结果可靠性强等优点得到了广泛的重视。到目前为止，CD-DST技术已被应用于部分实体瘤的临床治疗和研究中，取得了一定程度的认可。本文主要针对近年来CD-DST技术在临床上的研究应用进行综述，以便为后续研究者提供一定的帮助。

1　CD-DST的原理及特点

在机体内，细胞外基质可以为细胞提供获取营养和排出代谢物的稳定生长场所。同样，肿瘤组织也是由肿瘤细胞、组织细胞和细胞外基质所构成，肿瘤细胞所处的微环境对肿瘤细胞的生长繁殖具有重要影响。CD-DST技术采用的胶原凝胶在37℃时可以形成三维立体的结构，模拟体内细胞的生长微环境，肿瘤细胞得以在类似体内的环境下生长，在其细胞形态、生长状态与体内肿瘤细胞相似的情况下对抗癌药物进行定量分析便可得到较准确的结果。

CD-DST技术的主要流程包括以下5部分：（1）原代肿瘤细胞悬液制备：取新鲜肿瘤组织机械分离，用组织消化酶消化2 h～3 h后，通过80 μm的筛网过筛形成单细胞悬液；（2）肿瘤细胞单层培养：将上述细胞悬液加入到I型胶原蛋白包被的细胞培养瓶中培养24 h，弃上清未贴壁死细胞；（3）胶原凝胶内培养：用胶原酶消化上述细胞得到细胞悬液，计数后将活细胞加入胶原凝胶混合液中混匀，在冰浴条件下接种于六孔板37℃培养，形成胶滴后加入培养基培养过夜；（4）待测药物添加：将待测抗癌药物加入六孔板中，继续培养24 h后清洗细胞除去抗癌药物，将细胞转移至无血清培养基中培养7 d；（5）结果分析和评估：利用中性红染色、甲醛固定，经扫描将图像传输到计算机，利用图像分析药物的抑制率，评估药物体外的杀伤效果［4］。具体流程如图1所示。

2　CD-DST技术的临床研究进展

2．1大肠癌

近年在我国，大肠癌的发病率也在逐年攀升。目前对于肿瘤治疗公认的最佳方案是进行个体化治疗，而其中首要的就是为大肠癌患者筛选敏感有效的化疗药物进行有针对的治疗。为患者进行药物敏感性的体外检测可以有效提高治疗效果，减少药物带来的不良反应。CD-DST技术在发展初期便被用于确定多种针对大肠癌的化疗药物的有效治疗浓度，其结果被应用于癌细胞的杀伤动力学试验。Ochiai［5］等人利用该技术检测大肠癌细胞对5-氟尿嘧啶（5-fluoropyrimidine，5-FU）的敏感性，并通过分析上述试验的数据明确了所检测患者对该药的反应程度与体外敏感性之间的关系。

近几年，随着药物基因组学的发展，发现化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应与基因的多态性和表达水平有关，其中药物的目标酶和代谢酶的表达和活性尤为重要。在该方面研究中，CD-DST技术主要参与探究大肠癌细胞中5-FU药物敏感性与相关代谢酶活性之间的关系，其中包括胸苷酸合成酶（thymidylate，TS）、二氢嘧啶脱氢酶（dihydropyrimidine，DPD）和乳清酸磷酸核糖转移酶（orotate phosphoribosyltransferase，OPRT）。研究人员认为DPD和OPRT活性具有预测5-FU药物敏感性的潜力，若将CD-DST技术与细胞酶活性检测相结合可能会更有效地预测药物敏感性［6］。参与肿瘤形成的一些关键分子，也在肿瘤细胞耐药性的形成中发挥着重要作用。Syndecan1分子（CD138）属粘附分子整合素跨膜粘结蛋白（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）家族成员，可与多种因子结合，参与组织器官分化发育、血管形成、组织再生等一系列生理过程的调节，并与肿瘤细胞归巢及转移等过程有关，也是判断某些肿瘤预后的指标。研究表明，Syndecan1分子在大肠癌细胞中的脱落增加，导致了癌细胞对CD-DST技术指导下的体外化疗的耐药性升高，这可能是由于Syndecan1分子的脱落使表皮因子生长受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）磷酸化增强继而下调了该通路的信号，最终导致了大肠癌细胞对化疗药物的耐药性升高［7］。笔者认为，由于CD-DST技术结果与临床化疗的相关性较高，可以利用CD-DST技术明确一些与肿瘤发生发展密切相关相关的分子对化疗的影响，以此来有针对性地筛选化疗药物，这将会对大肠癌个体化治疗的建立有着十分积极的意义。

不同时期的肿瘤对化疗的敏感性不同，在个体之间的差异更为显著。近期，在针对Ⅱ～Ⅲ期大肠癌的研究中发现在CD-DST技术辅助下以5-FU为基础的辅助化疗药物治疗的成功率为79．9%［8］；此后在利用CD-DST技术指导Ⅳ期大肠癌患者的用药治疗中，接受体外检测敏感药物治疗的患者比接受体外检测不敏感药物治疗的患者的药效反应率、无进展生存期和总生存期均提高2倍左右［9］，提示以CD-DST技术结果为依据选择的化疗方案能明显延长患者生存时间，改善患者预后。

为提高试验的准确率和成功率，研究者有针对性地对CD-DST技术进行了改进。杂菌污染是导致大肠癌细胞培养失败的主要原因，有试验表明提前用抗生素灌洗大肠癌标本可以有效控制杂菌污染，提高肿瘤细胞生长率［10］。在探究蛋白结合多糖-K（protein-bound polisaccharide，PSK）与氟尿嘧啶衍生物在胃肠道癌症抗癌作用关系的试验中，为更好模拟体内免疫环境，CD-DST体系中还加入了外周血单核细胞，即建立了免疫CD-DST技术（Immuno-CD-DST），并证实该改进可以更好地用于评估药物的免疫机制［11］。综上而言，通过一系列CD-DST技术在大肠癌治疗中的应用，证明该技术可有效地补充化疗准备期信息的不足，为通向大肠癌个体化治疗打下坚实基础。

2．2乳腺癌

全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势，每年约有50万人死于乳腺癌，近年来我国乳腺癌发病率的增长速度呈持续走高态势［12］。乳腺癌具有遗传异质性，不同患者的个体差异较大，因此乳腺癌的个体化治疗就显得尤为重要。在乳腺癌中，CD-DST技术多被应用于检测个体癌细胞对药物敏感性。CD-DST技术被用于检测以吡柔比星（pirarubicin，THP）和表柔比星（epirubicin，EPI）药物方案为基础的化疗药物对乳腺癌的化疗效果的结果表明CD-DST技术检测乳腺癌化疗药物敏感性的可行性高［13］。

和其它许多肿瘤一样，乳腺癌具有遗传异质性，这就提示我们可以通过分析乳腺癌相关标记物的表达并辅助应用CD-DST技术来建立个体化治疗方案。Ki67是一种与细胞增殖有关的核抗原，Ki67标记指数高的患者淋巴结转移率高，无瘤缓解期和存活时间短，与乳腺癌组织学分级、核分裂指数和淋巴结转移的情况密切相关。研究者利用CD-DST技术检测Ki67的表达与药敏性之间的关系，结果显示Ki67表达较高的乳腺癌患者对紫杉醇（paclitaxel，PTX）的药敏性也相应增高［14］。多二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly ADP-ribose poly merase-1，PARP1）是一种DNA修复酶，最新的一项研究中指出，细胞核内PARP1的表达量可以作为预测乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的指标［15］。研究发现，在CD-DST技术的指导下，乳腺癌细胞核内PARP1的高表达和癌细胞对紫杉醇与表柔比星敏感性的升高呈正相关，那些核内高表达PARP1的乳腺癌细胞对以蒽环类抗生素联合紫杉醇类药物为基础的化疗更敏感［15］。由此看来，CDDST技术是推动乳腺癌个体化化疗的又一有效技术，它以显著的优点加速了其在临床研究中的应用。

2．3胃癌

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，目前是世界上第四大癌症，发病率和死亡率均很高，每年大约有93．3万新发病例，约70万人死于胃癌［16］。胃癌早期症状不明显，部分患者仅出现消化道疾病的常见症状，发现时多已是晚期，手术常常只能达到缓解病情和短暂延长生存而达不到根治的效果，所以晚期胃癌的化疗就显得尤为重要。目前临床上影响化疗药物对胃癌的治疗效果的因素主要是多耐药性，而随着近些年兴起的CD-DST技术在胃癌中的应用，将有望改善这一现状并进一步推动建立胃癌的个体化治疗方案。有国内学者对CDDST技术在胃癌中的应用进行了多项研究，结果提示P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、血浆谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase π，GST-π）及TS三种酶的表达与胃癌多耐药性的形成有关，前两者和耐药性呈正相关，而TS酶与耐药性呈负相关［17］。在为胃癌患者筛选化疗药物时如果辅助以检测以上耐药相关分子的表达情况，可以更准确地筛选到有效的药物。CD-DST技术可以预测单独用药和联合用药对于胃癌患者的治疗效果。一项研究针对晚期胃癌患者的分层Ⅱ期临床试验中，应用CD-DST技术检测3种化疗方案对患者的体外效果并与体内疗效进行对比，结果显示体外敏感组的患者生存率明显高于体外耐药组，这进一步说明了CD-DST技术能较好地预测晚期胃癌患者对化疗药物的敏感性［18］。表明不同分化时期以及不同转移部位的胃癌细胞对化疗药物的敏感性有差异，应用CD-DST技术能更精准地检测其差异性。有学者利用CD-DST检测技术时发现不同分化程度的肿瘤细胞对于不同药物的敏感性不同，其中顺铂、奥沙利铂、5-FU对MGC-830、BGC-823、SGC-7901三种胃癌中分化细胞株的增殖均有显著的抑制作用，丝裂霉素仅对SGC-7901细胞有抑制作用，且试验结果测出的相关敏感度数值与临床数据基本一致，这就提示CD-DST的检测结果可以有效预测体内药物敏感度［19］。CDDST技术本身是一种体外药敏检测技术，尽管该技术模拟的肿瘤细胞生长微环境相较其他技术更接近体内情况，但差异仍难避免，故其结果须与临床数据相结合方可得出更加准确的结论。相信随着CD-DST在胃癌治疗中的应用越来越广泛，将对胃癌患者的个体化治疗产生更为积极的推动作用。

2．4胰腺癌

胰腺癌是一种恶性消化系统肿瘤。据统计，近些年全世界范围内的胰腺癌患者的死亡率由2．2／10万上升到10．5／10万［20］。胰腺癌恶性程度高，手术切除率仅10%，化疗是胰腺癌的主要治疗手段之一，但其单独用药或联合化疗的有效率很低。胰腺癌的化疗效果很差与肿瘤的个体差异性、多重耐药性（原发性、继发性）等因素有关，选择个体敏感药物进行个性化治疗是提高治疗成功率的关键。由于CD-DST技术中的胶原能抑制成纤维细胞的生长，且通过染色和图像分析技术可以很好地排除成纤维细胞对结果的干扰，因此非常适合于胰腺癌这种间质细胞成分多的肿瘤的体外化疗药物敏感性检测［21］。CD-DST技术在胰腺癌中的应用研究与其它类型的肿瘤相类似。CD-DST技术在胰腺癌中的应用主要集中于各种化疗药物针对肿瘤细胞的敏感性预测上，尤其是一线化疗药物，如5-FU、顺铂（cis-diamine dichloroplatinum，CDDP）、丝裂霉素（mitomycin c，MMC）。有报道称，一位患有胰腺实性假乳头状瘤（solid pseudopapillary tumor，SPT）的患者在进行了末梢胰切除术4年后病情复发，在应用CD-DST技术筛选出敏感药物的基础上进行治疗后，患者在第二次术后的1．5年中保持健康，没有发现肿瘤复发的迹象［22］。CDDST技术在胰腺癌中的应用方向也随着更加广泛的应用在不断扩展中。徐强［23］在2009年关于CDDST技术在胰腺癌中的应用研究中发现，胰腺癌细胞原代培养到一定程度时，成纤维细胞的生长开始占优势，最后肿瘤细胞被纤维类细胞包裹，这可能在体外模拟了胰腺癌硬癌的形成过程。令人更感兴趣的是，研究人员还在纤维细胞中发现了星状细胞的存在，这种细胞是胰腺癌细胞的“帮凶”，能促进胰腺细胞的纤维化［23］。进一步说明了CD-DST技术所营造的细胞生长微环境与胰腺癌细胞在体内的环境拟合度较高，同时也为CD-DST技术在胰腺癌乃至其它肿瘤的研究应用提供一个新思路，即模拟肿瘤细胞在体外生长过程中的病理及生化改变。

2．5非小细胞型肺癌

非小细胞肺癌患者约占所有类型肺癌患者的80%，其中约75%的人被发现时已处于中晚期［24］。非小细胞肺癌目前主要的治疗手段是化疗，紫杉烷类化合物以及顺铂是治疗非小细胞肺癌关键的化疗药物。然而，非小细胞肺癌患者对这些化疗药物的敏感性并不清楚，因此，需要一项能够指导非小细胞肺癌患者用药的技术，从而减小无效用药的概率，CD-DST技术应其所需。考虑到体内外药物作用效果的差异，需要先验证CD-DST技术的临床关联性。就非小细胞型肺癌而言，在CD-DST技术指导下的化疗结果中，预测化疗反应的准确率约为70%，且对于淋巴结复发转移的非小细胞肺癌的准确率更高，达到了86%［25］。CD-DST技术的临床关联性较好，可以在临床通过预测回应率和药物有效率来指导非小细胞肺癌患者选择化疗药物，使用CD-DST技术选取的化疗药物可以延长非小细胞型肺癌患者的生存时间及提高患者的生存质量。

对于无法采取切除手术的非小细胞肺癌患者，CD-DST技术可以为他们选择化疗药物，选择成功率约为61%，使用了由CD-DST技术筛选的化疗药物后，患者的临床回应率约为70%［26］。同样，对已切除癌变部位的非小细胞肺癌患者，CDDST技术也可用于帮助患者选择合适药物以防止术后复发，提高临床手术的效果［27］。CD-DST技术给非小细胞肺癌患者提供了更佳的个体化治疗，但此项技术在该型癌症方面的应用尚未成熟，其在非小细胞肺癌中的应用也有局限，对已发生转移的非小细胞肺癌患者，CD-DST技术有效率较低，如骨转移和胸膜转移，其检测结果与临床反应关联不大，这意味着，对于某些抗癌药物，癌转移的路线和位置可能会影响CD-DST技术的预测效果［28］。

2．6CD-DST技术在其它肿瘤中的研究进展

CD-DST除了在以上提到的肿瘤的临床研究有应用之外，还在其它很多肿瘤上有所应用，比如卵巢癌、宫颈癌、头颈鳞癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、恶性胸膜间皮质瘤等。曾有报道称一例脾脏组织肉瘤患者接受了CD-DST指导下的化疗药物治疗，这也是相关病例的首次报道，结果证实治疗十分有效［29］。关于黑色素瘤的一项研究表明CD-DST技术可以用于体外评估黑色素瘤对化疗药物敏感性，但少数药物除外，比如抗黑瘤素，因其为前体药，须经体内酶的转化释放出活性药物方能发挥药效，这也指出了CD-DST技术应用的一个限制因素［30］。CD-DST技术在更多肿瘤中的应用还有待进一步实验探究。

3　总结与展望

目前化疗已由传统的经验性治疗逐步优化为个体化治疗，而在其中不可或缺的就是体外药敏检测技术，通过这种技术可以前瞻性地指导患者的临床用药，对个体化治疗方案的建立具有重大的意义。CD-DST技术作为其中新兴的先进技术，有着其它技术不可比拟的优势。CD-DST技术最先由日本学者创立，其后的研究也主要集中在日本，笔者所能查阅到的文献多数由日本学者提供，而且日本已有公司将该技术产业化。我国的研究开展得较晚，但是发展很迅速，取得了丰硕的研究成果。CD-DST技术的应用研究在肿瘤个体化治疗中十分热门，目前主要应用于预测肿瘤对于各种药物的化疗敏感性，为患者筛选有效的抗癌药物，另外还可以用于与肿瘤相关的临床研究、化疗药物的开发等等。CD-DST技术具备的所需细胞少、特异性高等优点，弥补了当前大部分临床化疗药敏检测技术的弊端，并且扩大了其在临床上的应用范围。大量的国内外临床试验均证实了其良好的效果，该技术的应用能指导临床科学用药，真正达到个体化治疗的目的，提高肿瘤患者的治疗效果。不过和传统方法一样，CD-DST技术的发展也存在着一些制约，如体外细胞生长环境无法完全模拟肿瘤体内环境，药物浓度及持续时间受给药途径、肝肾功能等各种因素影响而无法完全再现该浓度变化、某些药物须经代谢转化或免疫介导发挥作用而体外药敏试验无法很好体现等等。对于这些不足之处研究者们已经开始在寻求改进的方法，以让CD-DST得到更为广泛的应用，比如上文提到的Immuno-CD-DST技术等。笔者认为，未来CD-DST技术的发展方向应集中于如何更有效地使胶原内的环境尽可能地接近体内肿瘤细胞生长微环境以及将该技术与肿瘤相关分子检测技术相结合以探究相关分子在肿瘤发生发展中所起的作用等方面。随着该技术的进一步发展以及对相关理论和技术更深入的研究，体外模拟的细胞生长环境会和体内更加接近，这将使CD-DST技术的临床应用更加广泛。总而言之，CD-DST技术已经被国内外医学工作者广泛认同，并且随之在临床应用的逐步深入及不断改进，该技术将会在指导个体化治疗方案的建立以及抗癌药物相互作用的研究和新药研发等方面得到更进一步的发展应用，对临床的真正应用起到非常重要的作用。

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•综述•

Advance of collagen gel droplet-embedded culture drug sensitivity test in anticancer chemotherapy：a personalized medicine in cancer treatment

XU Wei, LI Wendi, DENG Tianying, ZHANG Zhigao, DU Hongyan★
(School of Biotechno1ogy, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 510515)

[ABSTRACT]The drug sensitivity of tumor cells is one of the critical issues to conduct individualized therapy for cancer patients. One of the therapeutic approaches is in vitro anticancer drug sensitivity test. Collagen gel droplet-embedded culture-drug sensitive test (CD-DST) is one of the best chemosensitivity tests, and is apparently superior to other methods currently available, because it requires a low number of the cells, has a short turn-around time and involves a simple and easy procedure. Since its establishment, CD-DST has been extensively applied and evaluated in clinical studies for the treatment of malignant tumors. It has been demonstrated that the chemotherapeutic protocols designed according to the results of CD-DST shows a high degree of fitting to the clinical scenario with high therapeutic efficacy and remission rate. CD-DST, as a guideline for the therapeutic decision making, is indispensable in individualized chemotherapy for cancer patients, and it may achieve more extensive clinical application with advance of new techniques. In this article, we review the establishment and advance of CD-DST, hoping to provide some basis for the future study.

[KEY WORDS]Chemosensitivity assay in vitro; Tumor; CD-DST; Chemotherapy

通讯作者：★杜红延，E-mail：gzduhongyan＠126．com

基金项目：国家教育部博士点基金（20134433120020）；国家自然科学基金（81401920）；南方医科大学基础研究前期启动项目（QD2013N005）