全反式维甲酸对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖及凋亡的影响

陈艳霞，房向东，黄翀，秦晓华，邹宏昌，徐承云，徐高四，涂卫平



全反式维甲酸对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖及凋亡的影响

陈艳霞，房向东，黄翀，秦晓华，邹宏昌，徐承云，徐高四，涂卫平△

摘要：目的探讨全反式维甲酸（ATRA）对高糖诱导人HK-2细胞增殖及凋亡的影响，以期延缓糖尿病肾病（DN）。方法体外培养HK-2细胞，随机分为6组：空白组（未加任何刺激物）、高糖组（加D-葡萄糖30mmol/L）、高渗组（加入甘露醇24.5mmol/L）、低浓度ATRA组（加入ATRA 1×10-7mol/L+D-葡萄糖30mmol/L）、中浓度ATRA组（加入ATRA 1×10-6mol/L+D-葡萄糖30mmol/L）、高浓度ATRA组（加入ATRA 1×10-5mol/L+D-葡萄糖30mmol/L）。各组细胞培养48h。MTT法检测各组细胞增殖情况，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果空白组与高渗组细胞光密度（OD）值和凋亡率差异无统计学意义。高糖组较空白组、高渗组细胞增殖减少，凋亡率增加；低浓度、中浓度、高浓度ATRA组细胞增殖均较高糖组增加，且低、中及高浓度ATRA组依次增加，凋亡率较高糖组减少，且低、中及高浓度ATRA组依次减少（均P＜0.05）。结论ATRA可促进高糖诱导的HK-2细胞增殖，抑制其凋亡，并与ATRA浓度可能具有一定的依赖性。

关键词：细胞增殖；细胞凋亡；体外研究；全反式维甲酸；肾小管上皮细胞

糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的常见并发症，1型糖尿病中DN的患病率约为33%～40%，2型糖尿病中DN具有渐进性进展及不可逆转的特点[1]。DN的发病机制复杂，防治困难，因此，从DN的发病机制着手寻找有效的防治方法一直是研究热点[2]。全反式维甲酸（ATRA）是体内天然维生素A的衍生物[3]，具有抗氧化、调节细胞分化和抗凋亡等多种生物学功能[4]。本研究旨在探讨ATRA对高糖诱导人HK-2细胞增殖及凋亡的影响，以期为延缓DN进展提供参考。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器HK-2细胞株（ATCC细胞库）；ATRA、Y27632、D-葡萄糖、甘露醇(美国Sigma公司)；DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；MTT溶液（南京森贝伽生物公司）；流式细胞仪(美国Beck⁃man公司)，酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2细胞培养及分组HK-2细胞传代培养于6孔培养板中，培养生长至80%～90%整合后，各孔按随机数字表法进行分组：空白组（未加任何刺激物）、高糖组（加入D-葡萄糖30mmol/L）、高渗组（加入甘露醇24.5mmol/L）、低浓度ATRA组（ATRA 1×10-7mol/L+D-葡萄糖30mmol/L)、中浓度ATRA组（ATRA 1×10-6mol/L+D-葡萄糖30mmol/L)、高浓度ATRA组（ATRA 1×10-5mol/L+D-葡萄糖30mmol/L)，各组细胞培养48h。收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的光密度（OD）值。实验重复3次。

1.3流式细胞术检测细胞凋亡采用不含EDTA的胰酶消化收集培养48h后的各组细胞。1h内流式细胞仪上测各组细胞的早期凋亡率。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件处理数据。符合正态分布的计量数据用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。检验水准为α=0.05。

2　结果

2.1各组细胞增殖情况比较空白组与高渗组细胞OD值差异无统计学意义。高糖组较空白组、高渗组细胞OD值减小；低浓度、中浓度、高浓度ATRA组OD值均较高糖组增加且低、中及高浓度ATRA组依次增加（均P＜0.05），见表1。

Tab.1　Comparison of proliferation and apoptosis between six groups表1　各组细胞增殖与早期凋亡率结果比较（n=3，±s）

Tab.1　Comparison of proliferation and apoptosis between six groups表1　各组细胞增殖与早期凋亡率结果比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白组比较，b与高糖组比较，c与低浓度ATRA组比较，d与中浓度ATRA组比较，均P＜0.05

组别空白组高糖组高渗组低浓度ATRA组中浓度ATRA组高浓度ATRA组F OD值0.379±0.009 0.264±0.007a0.380±0.008b0.292±0.006ab0.327±0.005abc0.352±0.006abcd127.365＊＊凋亡率(%) 0.977±0.009 7.746±0.183a0.983±0.007b4.960±0.111ab3.736±0.073abc2.873±0.080abcd2 670.747＊＊

2.2各组细胞凋亡情况的比较空白组与高渗组细胞凋亡率差异无统计学意义；高糖组凋亡率较空白组、高渗组明显增加；低、中、高浓度ATRA组较高糖组减少，且随着ATRA浓度升高凋亡率降低（均P＜0.05），见表1、图1。

Fig.1　　Cell apoptosis in six groups图1　各组细胞早期凋亡的情况

3　讨论

DN是导致终末期肾脏病的关键因素，世界新增的血液透析患者中35%～40%是由DN进展而来[5]。肾小球硬化损伤是DN的一个初始事件，肾脏细胞凋亡可促进DN的进展。早期2型DN患者肾脏凋亡较正常人肾脏高约3～6倍，DN患者肾小球、肾小管及血管内皮细胞的凋亡随着DN进展广泛增加[6]。ATRA是体内重要的生物活性物质，具有调节细胞增殖及凋亡的作用。一些研究报道，ATRA可以在某些肾脏疾病中起保护作用[7-8]，但其具体作用机制尚不清楚。既往研究发现，ATRA对肿瘤细胞具有抑制增殖及促进凋亡的作用[9]。目前研究发现，ATRA可诱导碱性成纤维细胞生长因子的产生，促进细胞的增殖及分化[10]。ATRA可以诱导多种类型细胞凋亡，尤其是癌细胞，其作用机制可能与ATRA调节多种凋亡相关基因表达或信号通路有关[4]。ATRA参与细胞凋亡过程具有细胞特异性，可诱导某些受损细胞的凋亡，而对其他细胞提供保护抗凋亡信号[5- 6]。但ATRA对高糖诱导HK-2细胞凋亡影响的报道甚少。

因此，本实验研究了不同浓度ATRA对高糖诱导HK-2细胞增殖及凋亡的影响。本研究结果显示，空白组与高渗组细胞增殖比较差异无统计学意义，提示在体外培养的HK-2细胞，高糖造成的高渗环境不影响HK-2细胞的增殖；高糖组较空白组、高渗组细胞增殖减少，表明高糖能抑制HK-2细胞的增殖，与本研究前期研究结果一致[11]。另外，低浓度、中浓度、高浓度ATRA组细胞增殖均较高糖组增加，表明予以高糖培养的HK-2细胞加入ATRA进行干预后，HK-2细胞增殖受抑制的作用减弱，提示ATRA可能通过某种作用机制逆转高糖诱导的HK-2细胞的增殖。本研究显示，低、中、高浓度ATRA组凋亡率较高糖组减少，低、中及高浓度ATRA组依次减少，表明高糖可诱导HK-2细胞凋亡，而予以ATRA进行干预后，HK-2细胞的早期凋亡减少，且呈现出实验范围内的浓度依赖性，提示ATRA对DN患者肾脏具有保护作用，但其具体机制尚不明确。高糖作用HK-2细胞后可激活多种信号通路，笔者推测，ATRA可能通过某种信号通路调节细胞增殖与凋亡的作用。另外本研究采用的ATRA浓度为1×（10-7～10-5）mmol/L，低、中及高浓度ATRA组细胞增殖依次增加，而凋亡率依次减少，表明ATRA对高糖诱导的HK-2细胞增殖作用与ATRA浓度可能具有相关性，且具有双向调节的作用。但本实验研究的ATRA浓度有限，其浓度依赖性及最佳作用浓度还有待进一步研究。后续实验将进一步探讨ATRA对高糖诱导HK-2细胞过程中凋亡相关基因表达及信号通路的影响，探讨ATRA对高糖诱导HK-2细胞增殖及凋亡的可能作用机制。

参考文献

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（2015-05-28收稿2015-07-22修回）

（本文编辑陆荣展）

实验研究

Effects of ATRA onhigh glucose-induced proliferation and apoptosis of renal tubular epithelial cells

CHEN Yanxia, FANG Xiangdong,hUANG Chong, QIN Xiaohua, ZOUhongchang, XU Chengyun, XU Gaosi, TU Weiping△
Department of Nephrology, The Second Affiliatedhospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China
△Corresponding Author E-mail：891289589@qq.com

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) onhigh glucose-induced proliferation and apoptosis inhumanhK-2 cells，and to provide a reference for slowing down the progress of diabetic nephropathy (DN).MethodshK-2 cells were cultured in vitro and were divided into six groups: blank group (without stimulants),high glu⁃cose group (D-glucose 30mmol/L),high permeability group (mannitol 24.5mmol/L) and low concentration of ATRA group (ATRA 30mmol/L 1×10- 7mol/L+D-glucose 30mmol/L),middle concentration of ATRA group (ATRA 30mmol/L 1×10- 6mol/L +D-glucose 30mmol/L) andhigh concentration of ATRA group (ATRA 1×10-5mol/L+D-glucose 30mmol/L).Cells of six groups were cultured for 48hours.MTT assay was used for detection of cell proliferation.Flow cytometry was used for de⁃tection of cell apoptosis.Results There were no significant differences in OD value and apoptotic rate between the blank group and thehigh permeability group.The cell proliferation was decreased inhigh glucose group than that of blank group andhigh permeability group，but the apoptotic rate was increased.The cell proliferation was significantlyhigher in low con⁃centration,medium concentration andhigh concentration of ATRA groups than that ofhigh glucose group, and the apoptotic rate was lower than that ofhigh glucose group, and the changes were in a concentration dependentmanner (P＜0.05).Con⁃clusion ATRA can promote the proliferation ofhK-2 cells induced byhigh glucose, and inhibit the apoptosis, and whichhas a certain relevance with the concentration of ATRA.

Key words:cell proliferation; cell apoptosis；in vitro；all-trans retinoic acid; renal tubular epithelial cells

通讯作者△E-mail：891289589@qq.com

作者简介：陈艳霞（1988），女，硕士，主要从事延缓慢性肾脏病进展的研究

基金项目：江西省卫生厅科技项目（20151BBG70173）

中图分类号：R692

文献标志码：A

DOI:10.11985/58997

作者单位：南昌大学第二附属医院肾内科（邮编330006）