无创性游离DNA产前诊断胎儿染色体异常的现状

王倩，杨蔚

无创性游离DNA产前诊断胎儿染色体异常的现状

王倩，杨蔚△

唐氏综合征（DS）是导致儿童智力先天残疾的重要原因。常规的产前诊断操作如羊膜穿刺术、绒毛活检等方法存在风险较高等不足。产前无创性游离DNA（cfDNA）诊断可避免对胎儿的侵入性操作，通过孕妇外周血循环中胎儿cfDNA对唐氏综合征及其他遗传性疾病进行无创早期诊断，受到临床的广泛关注，成为产前诊断领域的研究热点。尽管近年来cfDNA诊断技术具有较大发展，但此技术在广泛应用于临床前，还面临着技术、经济、法律以及伦理学等诸多问题尚待解决。综述无创性cfDNA产前诊断胎儿染色体异常的现状。

产前诊断；唐氏综合征；普查；DNA；知情同意；伦理学，医学

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：490-492）

唐氏综合征（Down syndrome,DS）是儿童智力残疾的最常见原因之一，在活产中的发病率约为1/ 800。非整倍体的产前诊断（prenatal diagnosis,PD）通常通过游离DNA（cell free DNA,cfDNA）对胎儿染色体非整倍体进行诊断，避免了羊膜穿刺术（chorionic villus sampling,CVS）或绒毛取样等侵入性操作对产妇和胎儿造成的危险。在许多西方国家，通常通过采集母亲的血清进行cfDNA诊断，再根据超声标记来建立数学模型，然后为每位妇女携带胎儿DS的风险评分，最后才为评分处于高风险的妇女提供侵入性产前诊断。

1　cfDNA诊断简介

羊膜穿刺术、绒毛活检或胎儿脐静脉取血等胎儿染色体检测方法价格昂贵，且有导致胎儿创伤、胎儿畸形、流产或宫内感染的风险，在妊娠15周后才能进行，且要等待3周才能得到结果，可导致0.3%～1%的胎儿流产。研究表明，羊膜穿刺术或绒毛活检等侵入性诊断可导致约1/200的流产率，为限制产前诊断的侵入性操作的数量，目前筛查DS普遍结合非侵入性、无风险的筛查方法[1]。而通过cfDNA诊断技术进行无创性胎儿染色体非整倍体诊断，可在妊娠早期提供结果，并大幅度减少侵入性操作次数，是一种新兴的产前诊断技术。

1.1cfDNA诊断的检测方法1997年首次发现孕妇血浆中存在少量的胎儿cfDNA，这一发现为无创性诊断奠定了基础。目前无创性诊断大多采集35岁以下、妊娠12～24周妇女的外周血，低温保存。孕妇从妊娠第7周开始即可检测到cfDNA，在最初3个月内cfDNA含量每周增加约21%，在随后的3个月进入平台期，在分娩前又迅速增加，分娩后2 h内迅速消失，此外母体清除cfDNA的速度非常快，半衰期通常只有几分钟。从母体外周血中提取的cfDNA可以反映当时胎儿的基因状态，并且在采样过程中不会对胎儿造成损伤。由此可见，孕妇外周血浆中的cfDNA是进行无创性产前检测的理想检材。检测是通过提取外周血血浆中的cfDNA片段进行高通量测序，将每条DNA片段与人类基因组图进行比对，最后根据生物统计学原理，评估胎儿的染色体非整倍体的风险值[2]。

1.2cfDNA诊断的应用范围目前我国普遍使用的产前诊断方法是血清学妊娠中期二联（甲胎蛋白和游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位）或三联（甲胎蛋白、游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位和游离雌三醇）检测，但是敏感度和特异度仍不尽如人意，约5%的假阳性率和65%～75%的检出率使临床医师难以做出准确的判断。无创性产前诊断可准确、安全、快速地检测胎儿染色体非整倍体疾病，因此近年来在产前诊断运用中取得迅速的发展[3]，在高风险孕妇人群中检测DS、18-三体综合征、13-三体综合征的高敏感度和高特异度已逐渐被认可。研究发现，由cfDNA筛选DS全染色体核型的分析结果高危妊娠的假阳性率只有0.5%，并可通过此项技术进行性别鉴定及性染色体连锁疾病、胎儿Rh系统基因型的检测、妊娠相关疾病、胎儿染色体病、胎儿染色体片段异常、父系单基因遗传病等多项产前诊断[4]。

2　cfDNA诊断的意义

由于目前DS无法治愈，因此产前基因诊断对维护孕妇生育自主性具有重要意义。孕妇能够选择是否接受孩子的病情，并为其出生做准备或终止妊娠。无创性基因诊断、妊娠中期超声诊断和早期风险评估曾经颇具争议，但在2007年出版的实务公告中，美国妇产科学会已建议将cfDNA产前诊断推荐给所有的妇女[5]。

有研究回顾性分析了2005年1月—2009年12月北京协和医院产前诊断中心所进行的羊水穿刺、绒毛活检、脐静脉穿刺及胎儿镜检查病例，羊水穿刺的流产率为1.35%，脐带穿刺部位出血44.9%，脐静脉穿刺失败率为8.16%[6]。cfDNA诊断可减少88%的羊膜穿刺术等侵入性操作，有效降低高危患者（35岁及以上的孕妇）的综合风险，提高DS检出率和减少正常胎儿的损失[7]。目前的非侵入性风险诊断可识别90%妊娠中的三体综合征，而检测阳性率占总人数的4%～5%。与妊娠早期超声诊断胎儿颈项透明层厚度的方法相比，cfDNA诊断减少了94%的医源性胎儿丢失，因此cfDNA诊断被认为是产前检测胎儿非整倍体的有效手段[8-10]。

3　cfDNA诊断的局限性

尽管近年来cfDNA诊断技术具有较大发展，但仍有许多技术局限性因素需要考虑。虽然有研究表明cfDNA诊断可有效检测DS、18-三体综合征和13-三体综合征，但是某些可由细胞遗传学方法检出的其他染色体结构异常却无法被检出，因此目前认为cfDNA诊断只对染色体数量异常（即非整倍体异常）检出率较高[11]。因此，学者们希望随着cfDNA技术的发展，可通过结合标记胎盘功能的生化标记物等方法，诊断妊娠并发症如子痫前期或胎儿生长受限相关的临床染色体异常[12]。同时，虽然cfDNA诊断能有效诊断高危妊娠妇女的胎儿非整倍体，但cfDNA诊断对正常妊娠妇女的诊断意义较低。此项技术运用于临床前，需要进一步验证cfDNA筛查对正常妊娠妇女也是一种有效的诊断方法[13]。目前cfDNA筛查技术仅限于单胎妊娠妇女，还无法诊断出三倍体的假阳性结果。据报道，假阳性结果可由胎盘嵌合体、消失的双胞胎或母体肿瘤等因素造成，并需要更多的研究来评定cfDNA诊断得出的母体、胎儿、胎盘的染色体之间不一致现象的原因[14-16]。

4　cfDNA诊断所涉及的伦理学问题

cfDNA诊断技术的应用要遵循医学伦理学原则，其涉及的伦理学问题主要是患者的生育自主权和知情同意权[17-18]。世界各国公认在进行医学实验时必须取得患者的知情同意。DS的产前检查已在临床开展了几十年，各种新方法、新技术的不断推出使DS的检出率显著提高。在DS的诊断中，知情同意与知情选择是医患关系中涉及的一个最基本的伦理学问题。医生需要告知患者DS是个什么样的疾病，为什么要进行产前诊断，让患者在完全了解的情况下自愿选择是否进行产前诊断。DS产前诊断涉及的伦理学问题包括：①产前诊断的医学指征；②确诊后是否选择流产；③无创性诊断技术。而且cfDNA诊断在妊娠中期获知诊断结果，很多地区认为妊娠中期的胎儿比妊娠早期胎儿有更高的道德地位和意义，因此要求cfDNA技术需不断完善，能够更早地获知诊断结果，并且产前诊断前需征得患者的知情同意[19-20]。解决重要的伦理、社会和法律问题，需要对患者和检测机构进行教育以加强保护生育自主权和知情同意权意识，构建完善的监管机制。

5　结语与展望

cfDNA筛查是产前诊断的一个重大突破，这项技术在妊娠早期有可能提供诊断结果和大幅度减少侵入性操作。通过母亲外周血浆中cfDNA检测获得胎儿信息现已成为产前诊断的研究热点。然而cfDNA筛查除了检测21-和18-三体异常，尚不能检测到所有的染色体异常，且其临床有效性、实用性以及风险性尚缺乏足够临床数据支撑。随着研究地不断深入，学者们对母体血浆中cfDNA的生物学特性的认知更加广泛。如何消除母体DNA的背景干扰，提高cfDNA浓度，从而提高诊断的准确率，已成为亟待解决的问题。研究发现，血浆中大多数cfDNA分子片段长度小于300 bp，而大多数母体来源的DNA分子片段长度大于300 bp，依据DNA分子片段长度的差异，特异性富集片段长度小于300 bp的DNA分子，从而可以达到高效富集cfDNA的目的。可以根据cfDNA来源、片段长度分布及清除机制以及生物学标记物等多方面特性，通过聚合酶链反应（PCR）、肽核酸、时间飞行质谱技术、定量PCR、数字化PCR、基因测序技术等提高其诊断的准确性和特异性。

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[本文编辑王昕]

Application of Non-Invasive Fetal Cell-Free DNA Test in Prenatal Diagnosis of Fetus Chromosomal Abnormality:A Review

WANG Qian,YANG Wei.

Department of Obstetrics and Gynecology,Tianjin Shuige Hospital，Tianjin 300090，China

YANG Wei,E-mail:yangwei.1970@163.com

Down syndrome(DS)is one of the important reasons for the intelligence congenital deformity in children.Regular prenatal diagnosis is not satisfied due to the invasive procedures,such as amniocentesis and chorionic villus sampling.Nowadays,the non-invasive cell-free DNA(cfDNA)screening and diagnosis can avoid those invasive procedures.The application of cfDNA test with the peripheral blood of pregnant women in the noninvasive prenatal screening and diagnosis of DS and other genetic diseases has

extensive attention in the field of prenatal diagnosis.Although the cfDNA diagnosis technology has been greatly developed in recent years, there are still many problems to be solved,such as technical,legal and social issues,before its extensive use.In this paper,the non-invasive cfDNA and its application in prenatal diagnosis were reviewed.

Prenatal diagnosis;Down syndrome;DNA;Informed consent;Ethics,medical

300090天津市水阁医院妇产科

杨蔚，E-mail：yangwei.1970@163.com

△审校者

（2016-08-02）