蛋白质乙酰化与精子DNA稳定性和精子活力

张蓓，崔毓桂



蛋白质乙酰化与精子DNA稳定性和精子活力

张蓓，崔毓桂△

【摘要】表观遗传学参与调节精子发生和精子形成，其中组蛋白及非组蛋白乙酰化对生精细胞染色质结构重建以及精子活力起关键作用。环磷酸腺苷（cAMP）反应元件连接蛋白（CREB）的结合蛋白（CREB-binding protein，CBP）和p300是两个乙酰化酶，能使核心组蛋白发生乙酰化，其乙酰化作用能被乙酰化酶抑制剂（INHAT）所抑制。睾丸特异的布罗莫结构域（BRDT）蛋白为保守的核蛋白，能够识别乙酰化和非乙酰化的组蛋白。在精子发生早期，BRDT调节基因转录；在精子形成阶段，BRDT识别高度乙酰化组蛋白，接着组蛋白被鱼精蛋白替代，从而使精子形成致密的染色质。非组蛋白α微管蛋白（α-Tubulin）去乙酰化则降低精子活力，在少弱精患者精子中乙酰化α微管蛋白（acetylated α-tubulin，Ac-α-Tu）明显下降。

【关键词】精子发生；组蛋白类；后成说，遗传；乙酰化作用；微管蛋白；不育，男（雄）性

△审校者

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：118-122）

表观遗传学修饰有严格的时空特异性，在精子发生过程中起重要作用，其中组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化已成为研究热点。这些修饰可通过改变组蛋白与DNA以及组蛋白与组蛋白之间的相互作用，改变染色质结构，调节转录，影响精子发生[1]。在原始生殖细胞的有丝分裂过程中，致密染色质中的DNA甲基化能启动父系特殊的遗传印迹。在精母细胞的减数分裂过程中，DNA磷酸化促进染色质重组和XY染色体的形成，并且DNA泛素化、类泛素化以及融入染色质的H2AZ和H3.3等组蛋白异构体也参与XY染色体的形成。DNA双链断裂，染色质修饰异常，mRNA和其他非编码RNA表达的改变均可导致减数分裂过程中染色体不分开[2]。本文综述蛋白质乙酰化及其与精子DNA稳定性和精子活力的关系。

1　组蛋白乙酰化与DNA稳定性

1.1精子形成与组蛋白乙酰化精子形成过程中，组蛋白高度乙酰化后染色质松散，有助于组蛋白向鱼精蛋白的转换[2]。目前已确认5种组蛋白：H1、H3、H4、H2A和H2B，编码它们的基因没有内含子并且其转录产物没有多聚A尾（ployA），其中组蛋白H3和H4最保守[3]。核心组蛋白为H2A、H2B、H3和H4，分子质量相对较小（11～15 ku），成对的组蛋白形成核心组蛋白八聚体。约147 bp的DNA线圈样包绕核心组蛋白形成1.75个超螺旋，从而形成核小体的核心结构。核小体作为染色质的基本单元，由H1等组蛋白连接，进一步折叠成为高度致密的染色质结构[4]。与体细胞不同，生殖细胞DNA包裹了不同数量的睾丸特异性核心组蛋白异构体，如：睾丸特异性组蛋白H2A（testis-specific histone H2A，TH2A）、TH2B和TH3，以及连接组蛋白异构体H1t和HILS1[5]。组蛋白以及组蛋白异构体的乙酰化对正常的精子发生是必需的，其能通过促进基因转录影响精子发生并且保证遗传物质稳定传递。而非组蛋白乙酰化对精子发生也有重要的调节作用，如α微管蛋白（α-Tubulin）去乙酰化则降低精子活力，在少弱精子症患者的精子中乙酰化α微管蛋白（Ac-α-Tubulin）明显下降[6]。

组蛋白乙酰化是指在组蛋白的氨基端赖氨酸残基上引入疏水的乙酰基。这使DNA与组蛋白间的静电引力和空间位阻增大，两者间的相互作用减弱，DNA易于解聚，染色质变得松弛，从而有利于聚合酶Ⅱ（PolⅡ）对基因进行转录。组蛋白的去乙酰作用则与基因沉默有关[7]。精子发生过程中，精原细胞和细线前期精母细胞的核心组蛋白H2A和H2B、H3 和H4高度乙酰化；在延伸型精子细胞中，乙酰化的核心组蛋白再次出现[8]。精原细胞和前细线期精母细胞中高度乙酰化的组蛋白能促进基因转录以供减数分裂所需。除了常见的几种核心组蛋白乙酰化能减弱其与DNA的相互作用，TH2B的氨基端乙酰化也有相同的作用。与核心组蛋白相似，精原细胞中乙酰化的TH2B最丰富（28.9%），而精母细胞（8.3%）和圆形精子细胞（11.2%）中相对较低[9]。

1.2组蛋白乙酰化酶（HATs）和去乙酰化酶（HDACs）

至少有5类HATs[10]：CBP/p300家族、PCAF/GCN5家族、SRC/ACTR家族、TAFⅡp250家族和MYST家族。其中CBP/p300可以乙酰化所有4种核小体核心组蛋白，并且在不同的组蛋白上有特定位点和多位点乙酰化方式[11]。然而，组蛋白赖氨酸残基乙酰化是受HATs和HDACs动态调节的。迄今发现约18种HDACs，可分为4类：第Ⅰ类包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10，与酵母HDA1同源，皆呈磷酸化依赖，穿梭于细胞质和细胞核之间；第Ⅱ类包括SIRT1～7共7种，与酵母SIR2a同源；第Ⅲ类包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8，与酵母转录调节因子RPD3同源，除HDAC3能穿梭于细胞质和细胞核，其余都存在于细胞核中；第Ⅳ类包括HDAC11[12]。

HATs与HDACs相互协调，共同调节精子发生。精子DNA分裂指数（DFI）与HAT活性呈正相关，正常精子形态比例与乙酰化酶指数（HAT/HDAC活性比值）呈负相关[13]。组蛋白乙酰化能促进精子发生过程中重要基因的转录。睾丸组织特异性基因表达受各种因素调节，如：启动子、增强子以及长链非编码RNA（lncRNAs）。有一保守的非编码序列CNS1可作为小鼠睾丸精母细胞特异性黏附分子1（Tcam1）基因的一个新的增强子。lncRNA-Tcam1的转录与H3乙酰化相关[14]。在精原细胞系GC-1中，启动子区域组蛋白H3的乙酰化和H3赖氨酸4位点二甲基化能促进精原细胞Pou5f1（POU domain class 5 transcription factor 1）和胶质细胞源性神经营养因子受体α1（glial cell line derived neurotrophic factor family receptor alpha 1，Gfrα1）的转录，并且受HDACs和组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶1（lysine specific demethylase 1，KDM1）影响。

Gfrα1定位于A型精原细胞，包括As、Apair和Aaligned精原细胞，并与Pou5f1共定位。在睾丸干细胞中敲除Gfrα1会导致细胞增殖减低，Pou5f1以及其他分化标记物表达增多，干细胞向精原细胞分化。Pou5f1又称为Oct4，该转录因子在精原细胞中高度表达，被敲除后原始生殖细胞凋亡增多，其表达随着精原细胞分化而降低[15]。在人类精原细胞、精母细胞、延伸型精子细胞以及射出精液的精子中，免疫组化显示H3K9ac阳性。在正常男性和不育男性精子中，H3K9ac结合的基因序列存在差异：在正常男性精子中，H3K9ac结合CRAT、G6PD、MCF2L等启动子，结合SOX2、GAPDH、STK11IP、FLNA、PLXNA3、SH3GLB2、CTSD等外显子，结合TH等基因间隔区；在不育男性精子中，H3K9ac只结合CRAT、G6PD等启动子，SH3GLB2等外显子[16]。H4K12ac在转录起始位点前后2 kb处表达丰富，成熟精子的H4K12ac对应启动子表达基因是精子发生的重要基因，其中mRNA表达最高的是PHF7（testis-specific PHD finger protein-7），提示H4K12ac可能激活该基因的表达[17]。新生儿时期暴露于苯并芘（BaP）能长远地破坏睾酮生成和精子发生，可能是通过降低类固醇激素合成快速调节蛋白（steroidogenic acute regulatoryprotein，STAR）启动子H3乙酰化水平而作用的[18]。

1.3组蛋白乙酰化与鱼精蛋白取代越来越多的证据表明，在精子形成早期，精子染色质组装与体细胞相似，即组蛋白参与形成经典的核小体核心颗粒。精子形成过程中，组蛋白被中间过渡蛋白所取代，紧接着过渡蛋白又被鱼精蛋白P1和P2所替代。鱼精蛋白是富含半胱氨酸和精氨酸的蛋白质，负责精子最终致密染色质的形成[19]。在整个转换过程中发生组蛋白被替换、DNA链断裂，在这些事件发生前有一标志性事件，即组蛋白H4发生高度乙酰化。因此，组蛋白H4高度乙酰化被当作组蛋白分离并触发接下来的蛋白转换过程的起始信号[20]。

蛋白酶体激活剂PA200及其在酵母中的同源类似物Blm10能与蛋白酶体的20S亚基结合，促进小肽段及松散的Tau蛋白水解，PA200/Blm10通过核心组蛋白的乙酰化调节蛋白酶体降解，这可能是乙酰化调节组蛋白降解，促进精子生成的机制之一[21]。用维甲酸灭活乙酰化酶，能阻碍组蛋白分离以及鱼精蛋白为基础的染色质结构的形成，从而阻碍精子细胞进一步分化；用乙酰化酶抑制剂古曲抑菌素A （trichostatin，TSA）抑制乙酰化酶后，圆形精子细胞核中组蛋白高度乙酰化已经形成，但精子并未形成以鱼精蛋白为基础的染色质结构，因此，在精子形成的组蛋白向鱼精蛋白转换的过程中，组蛋白H4高度乙酰化是必需但不是唯一的[22]。

其他因子也参与组蛋白转换过程。与正常男性相比，不育男性患者睾丸中Chd5（chromodomain helicase DNA binding protein 5）表达降低。Chd5在组蛋白向鱼精蛋白替换的过程中起着多方面的调节作用，包括组蛋白H4的高度乙酰化、组蛋白异构体的表达、核小体的释放、DNA破坏的修复。Chd5缺陷也能导致过渡蛋白（Tnp1/Tnp2）和鱼精蛋白（Prm1/ 2）表达紊乱[23]。DYP19L2基因缺陷导致人类精子缺乏症。DYP19L2敲除小鼠精子发生中组蛋白H4乙酰化的动态改变消失，并且缺乏过渡蛋白，从而不能发生鱼精蛋白取代，终止了精子形成[24]。

2　非组蛋白乙酰化与精子活力

2.1 Dazap1/Prrp（deletedinazoospermiaassociated 1/proline-rich RNA binding protein）的乙酰化和去乙酰化非组蛋白的乙酰化能调节胞质转运。Dazap1/Prrp主要在睾丸中表达，编码的RNA连接蛋白参与RNA的代谢过程，其在粗线期精母细胞和圆形精子细胞中的胞质和胞核中均有表达，而只在延伸型精子中胞质表达。Dazap1/Prrp在胞质胞核间穿梭受其150位点赖氨酸残基乙酰化调节。乙酰化Dazap1/Prrp存在于胞核，去乙酰化的Prrp存在于胞质尤其存在于线粒体中；非组蛋白的乙酰化调节RNA加工和翻译效率。

2.2 Mvh的乙酰化Mvh又称Ddx4（Dead box polypeptide 4），编码一种进化上保守的ATP依赖的DEAD盒RNA解螺旋酶，能调节mRNA的转录和翻译。在p46存在的情况下，一种胞质特异性乙酰化酶Hat1能直接乙酰化Mvh的405位赖氨酸残基，从而导致Mvh的RNA连接活性降低。再者，乙酰化的Mvh与 eIF4B（eukaryotic initiation factor 4B）mRNA作用力减弱，导致精子生成晚期eIF4B翻译水平增高[1]；非组蛋白的乙酰化能影响成熟精子活力。

其中：σdp、σds分别为P波和S波产生的动载；Cp、Cs分别为P 波和S波传播速度；υpp、υps分别为由P波和S波传播引起的质点最大震动速度；ρ为介质密度；μ为泊松比。

2.3 Tubulin乙酰化Tubulin是微管的主要成分，是分子质量为100 ku的α，β-异二聚体，而微管是精子重要的细胞结构之一。Tubulin乙酰化水平在精子发生过程中是动态变化的，在粗线期精母细胞中少量微管表达Ac-α-Tubulin，精子开始延伸时乙酰化水平有略微升高，Tubulin在有精子鞭毛形成的延伸型和致密型精子时乙酰化水平明显增高[25]。α-Tubulin在睾丸中表达的异构体有TUBA3C、TUBA4A 和TUBA8，其中TUBA3C和TUBA4A是乙酰化的。

少弱精子症患者中α-Tubulin明显降低，睾丸特异性乙酰化α-Tubulin变异体TUBA3C降低，TUBA4A增高，TUBA8降低，与正常精子相比，活力不足精子的TUBA3C/TUBA4A比例明显降低[6]。Tau是微管相关蛋白质，能促进微管聚合，增加稳定性。Tau蛋白磷酸化促进精子生成减数分裂过程，并与乙酰化的Tubulin有相互作用[26]。Ac-α-Tubulin在未分化的增殖的精原细胞上高表达，提示微管的转录后修饰在基膜处招募和锚定精原细胞中起重要的作用[25]。

3　蛋白质乙酰化的调控机制

3.1睾丸特异性布罗莫结构域蛋白（bromodomain testis-specific，BRDT）布罗莫结构域是高度保守的结构域，其能识别组蛋白和其他蛋白的乙酰化的赖氨酸残基。BET（bromodomain and extraterminal domain）家族核蛋白通常很保守，包含4种BET蛋白：BRD2、BRD3、BRD4和BRDT，其通常在氨基端有2个布罗莫结构域，羧基端有一个额外终端（ET）结构域。鉴于在转录和细胞周期中重要的调节作用，BRDT已被深入研究[27]。BRDT属BET家族，仅在生殖细胞中特异性表达，能识别和连接乙酰化和非乙酰化的组蛋白。

BRDT对男性生殖细胞分化是十分重要的，其在不同发育阶段以不同的方式影响精子发生，在早期生精阶段启动特殊的生精基因谱的表达，在精子形成过程中控制基因组的紧密包装[28]。在果蝇中，睾丸特异性表达的布罗莫结构域蛋白tBRD-1在睾丸中特异性表达，并且仅在有高度转录活性的初级精母细胞上表达[29]，tBRD-1与TATA盒连接蛋白相关因子的睾丸特异性同系物tTAFs部分共定位，并且这依赖于tTAF功能及初级精母细胞乙酰化状态[30]。有学者认为，在精子形成过程中，BRDT识别并移除高度乙酰化的组蛋白从而启动鱼精蛋白结合和染色体压缩致密[28]。

Smarcel（BAF57）是ATP依赖的SWI/SNF家族的一员，通过其氨基端形成染色质重组复合体。在单倍体圆形精子细胞中，BRDT与Smarce1的相互作用显著提高组蛋白乙酰化水平。因此，BRDT介导乙酰化依赖的且不受ATP影响的染色质重组[31]。免疫荧光显示BRD4在精子细胞核周围包绕环状，环内包含高度乙酰化的组蛋白。该环邻近顶体基板（顶体的细胞骨架），在顶体突变的小鼠中不形成BRD4环。BRD4和BRDT相互促进但又有区别，BRD4在精子发生的特异性基因上表达明显丰富[32]。

3.2 CBP/p300与蛋白乙酰化CBP/p300是转录复合物的辅助激活因子，包括3个锌指区域（cys，ZZ，TAZ），1个布罗莫结构域，1个HAT结构域和至少2个能和各种转录因子相互作用的独立结构域[33]。在结肠癌中，其能通过调节Wnt/β-catenin信号通路调节多种生物学行为[34]。在髓性粒细胞白血病多个亚型中，CBP/p300可能是一种潜在的治疗靶点[35]。应用激活剂TTK21激活乙酰化酶CBP/p300有利于成人的神经发生和长期记忆从而促进脑的功能[36]。

CBP/p300催化的组蛋白乙酰化在转录调节中也起着关键的作用，在卵母细胞的减数分裂时期（从卵泡破裂到第一次减数分裂末期），CBP在染色质区域的表达与组蛋白H3的AcH3/K18、AcH3/K23、dime-H3/R17是一致的，CBP的表达和这些组蛋白修饰的一致性一直持续到第一次减数分裂[36]。在CBP/ p300敲除小鼠中，生精细胞中一些代谢相关基因在减数分裂前高表达，在精母细胞和早期分裂后的细胞呈抑制状态，在延伸型精子时期再次激活[37]。乙酰化酶抑制剂（INHAT）为一复合体结构，包含髓性白血病相关的肿瘤蛋白SET/TAF-1β、TAF-1α和核磷酸化蛋白pp32，内源性INHAT能抑制组蛋白乙酰化酶CBP/p300活性[38]。

4　结语

精子发生过程中组蛋白乙酰化是重要的转录后修饰，受CBP/p300等乙酰化酶的影响，BRDT通过识别乙酰化的组蛋白进一步调节精子形成，在不育男性的生殖细胞中出现异常的组蛋白乙酰化定位及表达并有多个因子参与。非组蛋白（如Dazap1/ Prrp、Ddx4，尤其是Tubulin）的乙酰化能调节胞质转运，与精子活力相关。

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[本文编辑王琳]

（上接p112）

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[本文编辑秦娟]

·综述·

Protein Acetylation Promotes Sperm DNA Stability and Motility

ZHANG Bei，CUI Yu-gui. Clinical Center of Reproductive Medicine，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

【Abstract】During spermatogenesis, the protein acetylation level regulated by both acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs) ensures the reconstruction of highly condensed chromatin and sperm motility. The acetyltransferase CREB-binding protein (CBP) and p300 can acetylate all the histones of H2A, H2B, H3 and H4, which can be blocked by the complex of inhibitor of acetyltransferases (INHAT). Testis-specific bromodomain (BRDT) protein, a conserved nucleoprotein member of the bromodomain and extra-terminal (BET) family, can recognize those acetylated or unacetylated histones. BRDT participates in the regulation of gene transcription in the early stage of spermatogenesis; BRDT can recognize the high -acetylated histones, which mediates the replacement from histone to protamine in the elongated spermatids. The deacetylated α-Tubulin, one of nonhistone proteins, impairs the sperm motility. Acetylation α-tubulin (Ac-α-Tu) is reduced in patients with asthenozoosperm.

【Keywords】Spermatogenesis；Histones；Epigenesis，genetic；Acetylation；Tubulin；Infertility，male

收稿日期：（2015-11-09） （2015-12-28）

Corresponding author：CUI Yu-gui，E-mail：cuiygnj@njmu.edu.cn

通信作者：崔毓桂，E-mail：cuiygnj@njmu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金（81370754，81170559）；江苏省妇幼保健重点学科（FXK201221）；2012年度省级科技创新与成果转化项目（BL2012009）

作者单位：210029南京医科大学第一附属医院生殖医学科