涎腺腺样囊性癌微血管参数与肿瘤微血管模式的相关性研究

王蕊，李立恒，谢丽娟，胥爱文，王钟华

（河北北方学院附属第一医院口腔科，河北 张家口 075000）

涎腺腺样囊性癌微血管参数与肿瘤微血管模式的相关性研究

王蕊，李立恒，谢丽娟，胥爱文，王钟华

（河北北方学院附属第一医院口腔科，河北 张家口 075000）

目的 探讨涎腺腺样囊性癌微血管参数与肿瘤微血管模式之间的相关性。方法收集2005年1月至2015年7月我院涎腺腺样囊性癌患者(SACC组)148例，正常腮腺组织(对照组)50例，采用免疫组化染色方法检测两组受检者的转录活化因子-3(STAT3)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA及蛋白表达水平，分析其与微血管密度(MVD)之间的相关性。结果SACC组患者的STAT3和VEGF阳性表达率分别为32.0%和40.0%，均明显高于对照组的19.0%和18.0%，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；SACC组患者的STAT3、VEGF mRNA表达水平分别为(1.12±0.56)和(1.10±0.29)，均明显高于对照组的(0.82±0.31)和(0.72±0.26)，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；SACC组患者的STAT3、VEGF蛋白表达(3.23±1.99、2.56±1.86)与对照组(1.96±0.86、1.99±0.86)比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；STAT3及VEGF在SACC组中不同类型组织、有无淋巴结转移、TNM分期方面比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)；STAT3与VEGF表达呈正相关(r=0.85)；STAT3及VEGF蛋白表达水平与MVD差异表达具有相关性(r= 0.63，0.85)。结论涎腺腺样囊性癌微血管参数STAT3与VEGF与肿瘤微血管模式MVD之间具有相关性，在调控涎腺腺样囊性癌的血管生成方面，有望作为治疗靶点。

转录活化因子-3；血管内皮生长因子；涎腺腺样囊性癌；微血管密度；肿瘤微血管模式；相关性

腺样囊性癌(Adenoid cystic carcinoma，ACC)是颌面部肿瘤中发病率较高的肿瘤，也是涎腺最常见的恶性肿瘤，约占所有涎腺肿瘤的14.5%，约占全部涎腺恶性肿瘤的40%，极易发生局部浸润和神经侵袭转移，且其浸润性极强，易侵入血管，造成血运转移，预后不佳，但本病带瘤生存时间相对较长[1-2]。肿瘤的生长有赖于血管的生成，作为量化血管形成程度的微血管密度是血管形成的效应标志，同时还可作为反映肿瘤生物学良恶性情况的重要参数。近年来研究发现，在乳腺癌癌、肝癌、胆管癌、胃癌等多种肿瘤中STAT3及VEGF在调控肿瘤血管的生成中具有重要的作用[3]。本研究收集涎腺腺样囊性癌患者STAT3及VEGF的表达情况及MVD参数资料，通过分析STAT3及VEGF与SACC微血管新生及模式的演变规律，为腺样囊性癌的抗血管生成治疗研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2005年1月至2015年7月我院涎腺腺样囊性癌患者148例，其中男性87例，女性61例，年龄39～74岁，平均(55.3±10.7)岁；均为单侧腺体发病，其中左侧发病者77例，右侧发病者71例，发病部位位于舌下腺者27例，位于腮腺者101例，其余20例位于颌下腺。临床分期及病理类型参照国际WHO的诊断标准[4]进行分析判断，其中Ⅰ期40例，Ⅱ期35例，Ⅲ期39例，Ⅳ期34例；筛孔状51例、管状型50例、实体型47例。随机将148例患者分为对照组和实验组，每组74例。

1.2 治疗情况 本研究均为来院的初诊病例，均在我院完成手术治疗，其中单纯使用手术方法治疗的有85例，加用了放疗等辅助治疗手段的有63例，舌下腺者27例中有12例行口底的微波治疗，10例行上半颈部清扫，5例行颌下清扫加下颌骨切除术；位于腮腺者101例中行腮腺浅叶切除者38例，行全叶切除者32例，行残叶切除者21例，行腮腺癌联合根除术者6例，行扩大切除术者4例；20例位于颌下腺者中行颌下三角清扫术者8例，行联合根治术者8例，行上半颈清扫术者2例，行颌下三角清扫家颌骨切除者2例；加用放疗辅助治疗的63例患者中均采用面颈部联合的对穿野照射，其中有24例加入了根治性的同侧颈部照射，15例加入了预防性的同侧颈部照射。区域淋巴结的放疗剂量为50～70 Gy，原发灶的放疗剂量为30～70 Gy。对随访中发生复发的68例病例行手术治疗的有32例，其中15例追加了放疗。

1.3 方法

1.3.1 主要试剂、细胞与仪器 试剂：免疫组化试剂盒(武汉博士德)，PCR试剂盒(上海硕盟生物)，HRP标记山羊抗兔IgG，HRP标记山羊抗小鼠IgG(上海碧云天生物)，一抗：STAT3及VEGF和β-actin小鼠多克隆IgG(美国Santa Cruz公司)。仪器：转膜仪及电泳仪(美国伯乐公司)，高转速冷冻离心机(德国BiofugeStratos)，倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)，-80℃-4℃冰箱(日本松下)，高压消毒箱(美国Tuttnauer)，PCR仪(澳大利亚Rotor-gene)。

1.3.2 免疫组化检测STAT3及VEGF表达情况 每组选取25例病例进行试验，石蜡切片脱蜡至水→3%甲醇-H2O2室温孵育5 min，以清除内源性过氧化物酶活性→双蒸水冲洗，0.01 mPBS洗5 min→抗原修复后，0.01 mPBS洗3次，每次5 min→滴加10%正常山羊血清封闭游离的结合位点，减少非特异性染色→滴加一抗4℃冰箱过夜→0.01 mPBS洗3次，每次5 min→滴加生物素标记的二抗IgG，37℃孵育30 min→0.01 mPBS洗3次，每次2 min→滴加辣根酶HRP标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，0.01mPBS每次5 min，洗3次→DAB显色剂显色3～5 min，自来水冲洗终止显色→苏木素复染→酒精梯度脱水→二甲苯透明→封片。结果判定：倒置显微镜下细胞胞浆胞膜出现深棕黄色的染色定义为阳性细胞。

1.3.3 RT-PCR(半定量逆转录聚合酶链反应)方法 随机选取涎腺腺样囊性癌组25例，同时随机选取正常腮腺组织(对照组)25例，提取病变组织总RNA。行逆转录cDNA反应体系。由逆转录产物2 μL以及18sRNA或者一抗组成。按照RT-PCR操作步骤进行：预变性反应条件为5 min、95℃，梯度变性反应，30 s 94℃、30 s 60℃、60 s 72℃、7 min 72℃递减，共30次循环。所得PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果行凝胶成像系统分析。对得到的半定量结果进行对比分析，采用量化的吸光度积分值比较。

1.3.4 Western blotting方法 随机选取涎腺腺样囊性癌组25例，同时随机选取正常腮腺组织(对照组)25例，提取病变组织蛋白。按照SDS-PAGE凝胶电泳操作步骤进行，采用半干法转膜，加入一抗之后，4℃至少6 h孵育过夜，洗膜3次，每次5 min，再行二抗37℃孵育1 h，行ECL光化学法显色，彩色图像分析系统对吸光度测定。

1.4 统计学方法 数据分析运用SPSS 21.0统计软件。符合正态分布的数据采用均数±标准差(±s)表示，遵循正态分布而且方差齐性，两两比较采用LSD检验。应用Kruskal-wallis H检验进行多组间数据的比较，应用Mann-whitney U检验法进行两两数据之间比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组织化学法检测STAT3及VEGF表达水平 STAT3阳性细胞主要位于胞浆与胞核，其表现为胞浆及胞核呈棕色或者黄色，STAT3在SACC组与对照组中阳性表达率分别为32.0%与19.0%，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；VEGF主要位于肿瘤细胞的胞浆，VEGF在SACC组与对照组中阳性表达率分别为40.0%与18.0%，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

2.2 涎腺腺样囊性癌对STAT3及VEGF mRNA表达的影响 涎腺腺样囊性癌与对照组STAT3及VEGF mRNA表达情况比较，SACC组STAT3及VEGF mRNA的表达值高于对照组，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，STAT3与VEGF表达呈正相关，见表1。

2.3 涎腺腺样囊性癌对STAT3及VEGF蛋白表达的影响 涎腺腺样囊性癌与对照组STAT3及VEGF蛋白表达情况比较，SACC组STAT3及VEGF蛋白的表达值高于对照组，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，STAT3与VEGF表达呈正相关，见表2。

2.4 STAT3及VEGF表达与SACC临床参数之间的相关性 STAT3及VEGF在SACC组中不同类型组织、有无淋巴结转移、TNM分期方面差异具有统计学意义(P＜0.05)；STAT3及VEGF表达在不同性别、年龄、肿瘤分布情况差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表1 涎腺腺样囊性癌对STAT3及VEGF mRNA表达的影响(±s)

表1 涎腺腺样囊性癌对STAT3及VEGF mRNA表达的影响(±s)

组别对照组(n=50) SACC组(n=148)检验值P值STAT3 0.82±0.31 1.12±0.56 2.263 0.036 VEGF 0.72±0.26 1.10±0.29 2.369 0.038

表2 涎腺腺样囊性癌对STAT3及VEGF蛋白表达的影响(±s)

表2 涎腺腺样囊性癌对STAT3及VEGF蛋白表达的影响(±s)

组别STAT3VEGF对照组(n=50) SACC组(n=148)检验值P值1.96±0.86 3.23±1.99 4.693 0.001 1.99±0.86 2.56±1.86 3.353 0.026

表3 STAT3及VEGF表达与SACC临床参数之间的相关性

2.5 SACC中STAT3、VEGF的表达水平与MVD的相关性 STAT3及VEGF的蛋白表达水平与MVD差异表达具有相关性，见表4。

表4 SACC组织中STAT3、VEGF的表达与MVD的关系

3 讨 论

腺样囊性癌是颌面部肿瘤中发病率较高的肿瘤，也是涎腺最常见的恶性肿瘤，约占所有涎腺肿瘤的14.5%，约占全部涎腺恶性肿瘤的40%，5年生存率约为20%。极易发生局部浸润和神经侵袭转移。肿瘤微血管新生是其浸润和远处转移的前提条件[5-7]。目前评价肿瘤血管生成的标准是采用免疫组化的方法测定肿瘤微血管密度(MVD)。而肿瘤微血管存在多种不同的模式，势必对肿瘤的进展及预后产生影响，但是有关微血管模式与肿瘤进展以及脉管内癌栓、局部肿瘤浸润等高危因素的以及预后的关系未见报道[8-9]。近年来涎腺腺样囊性癌的发病率呈逐年上升的趋势，虽然治疗水平不断提高，但是患者的生存率并未得到明显提高，其转移与复发仍是死亡的主要原因[10]。

国内外目前对涎腺腺样囊性癌的诊断研究主要集中在病因学、遗传基因、早期诊断手段的研究，治疗方面研究主要集中在放射、化学以及手术方法改进等方面，虽然取得了一定进展，但该病的发病率及死亡率并未得到明显降低，说明研究的深度尚不足，研究还处于基础阶段尚未应用于临床[11]。由于涎腺腺样囊性癌作为恶性肿瘤，对人类生命具有重大的威胁。因此，进一步寻找有关涎腺腺样囊性癌复发、转移生物标记物及敏感特异是该病有效治疗、提高生存率的关键点。其次做好涎腺腺样囊性癌发病的预防及早期发现，减少其发病率和转移率，是今后研究的重要方向[12]。

STAT3是重要的核转录因子，可通过蛋白酪氨酸激酶或丝氨酸激酶诱导，在细胞因子和生长因子的作用下，可调控靶基因的转录，磷酸化并形成二聚体进入细胞核内，从而促进肿瘤细胞的增殖，与血管形成及侵袭转移具有密切的相关性[13]。VEGF具有增强微血管通透性，特异性作用于血管内皮细胞，为肿瘤的浸润转移提供条件，刺激内皮细胞促进肿瘤血管生成。研究表明肿瘤细胞中STAT3过度表达可上调了VEGF的水平，从而具有促进肿瘤的生长的作用[14]。本研究通过分析STAT3及VEGF与SACC微血管新生及模式的演变规律，为腺样囊性癌的抗血管生成治疗研究提供理论依据。结果显示，在SACC组中STAT3及VEGF的表达明显高于对照组，组间比较具有统计学意义，STAT3与VEGF表达呈正相关；STAT3及VEGF在SACC组中不同类型组织、有无淋巴结转移、TNM分期方面差异具有统计学意义；STAT3及VEGF表达在不同年龄、性别、肿瘤部分方面差异无统计学意义；STAT3及VEGF蛋白表达水平与MVD差异表达具有相关性。STAT3和VEGF在SACC中的表达呈正相关，证实血管生成与STAT3与VEGF的表达具有的密切关系。

综上所述，STAT3和VEGF在SACC中具有标志性作用，且与肿瘤的生长浸润呈的正相关性，考虑是STAT3通过上调VEGF表达从而诱导血管的生成，促进肿瘤的转移，因此，推测在涎腺腺样囊性癌的发生发展过程中STAT3、VEGF起到调控血管生成，进而促进肿瘤转移的作用，为进一步研究SACC抗血管靶向治疗提供了依据。

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Correlation between salivary microvascular parameters and microvessel mode.

WANG Rui,LI Li-heng,XIE Li-juan,XU Ai-wen,WANG Zhong-hua.Department of Dentistry,the First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between salivary microvascular parameters and microvessel modes.MethodsOne hundred and forty-eight patients with adenoid cystic carcinoma(SACC group)in our hospital and 50 subjects with normal parotid tissue(control group)were collected from January 2005 to July 2015.Activator of transcription 3(STAT3),vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA and protein levels were detected by immunohistochemical staining in the two groups,and their correlations with microvessel density(MVD)were analyzed.ResultsSTAT3 and VEGF positive expression rates in SACC group were 32.0%and 40.0%,respectively,which were significantly higher than 19.0%and 18.0%in the control group(P＜0.05).The STAT3,VEGF mRNA levels were(1.12±0.56)and (1.10±0.29)in SACC group,significantly higher than those in the control group of(0.82±0.31)and(0.72±0.26),with P＜0.05.The two groups had statistically significant difference in STAT3 and VEGF(P＜0.05)with(3.23±1.99)vs (1.96±0.86)and(2.56±1.86)vs(1.99±0.86).In SACC group,STAT3 and VEGF levels showed statistically significant difference between different types of tissue,with or without lymph node metastasis,and TNM staging(P＜0.05).STAT3 and VEGF expression were positively correlated(r=0.85).STAT3 and VEGF protein expression were correlated with the differential expression of MVD(r=0.63,0.85).ConclusionThere is a correlation between salivary microvascular parameters(STAT3 and VEGF)and microvessel mode MVD,which are expected to be as therapeutic targets in the regulation of angiogenesis in adenoid cystic carcinoma.

Activator of transcription 3(STAT3);Vascular endothelial growth factor(VEGF);Adenoid cystic carcinoma;Microvessel density;Microvessel mode;Correlation

R739.8

A

1003—6350（2016）12—1942—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.015

2015-11-26)

王蕊。E-mail：55768952@qq.com