重症中暑对大鼠心肌肾素-血管紧张素系统的影响

邱婷，郑维红，陆程翔

(厦门大学附属中山医院神经内科1、重症医学科2，福建 厦门 361004)

重症中暑对大鼠心肌肾素-血管紧张素系统的影响

邱婷1，郑维红1，陆程翔2

(厦门大学附属中山医院神经内科1、重症医学科2，福建 厦门 361004)

目的 探讨重症中暑对大鼠心肌肾素-血管紧张素系统的影响。方法选用雄性Wistar大鼠24只，应用随机数表法将大鼠分为正常对照组、热打击后2 h组、热打击后24 h组，每组8只。采用放射免疫法测定大鼠血浆和心肌肾素及血管紧张素Ⅱ活性，采用免疫组化法测定心肌血管紧张素Ⅱ-1、2型受体(AT1R、AT2R)蛋白表达水平。结果大鼠热打击后60 min左右肛温达到42℃，77 min左右平均动脉压下降25 mmHg，此时即重症中暑造模成功。热打击后2 h及24 h组大鼠血浆和心肌肾素-血管紧张素系统显著激活[血浆RA：(2 237.0±173.2)、(1 498.0±172.3)vs(785.4±43.2)，P＜0.05；血浆AngⅡ：(143.4±19.8)、(76.8±21.6)vs(42.8±8.6)，P＜0.05；心肌RA：(10.63±0.59)、(8.49±0.92)vs(1.66±0.38)P＜0.05；心肌AngⅡ：(279.9±11.3)、（212.5±10.1)vs(39.6±6.3)P＜0.05]；热打击后24 h组大鼠血浆和心肌肾素-血管紧张素系统仍处于激活水平，但较热打击后2 h组明显下降[血浆RA: (2237.0±173.2)vs(1498.0±172.3)，P＜0.05；血浆AngⅡ：(143.4±19.8)vs(76.8±21.6)，P＜0.05；心肌RA：(10.63±0.59) vs(8.49±0.92)，P＜0.05；心肌AngⅡ：(79.9±11.3)vs(212.5±10.1)，P＜0.05]。热打击后2 h及24 h组心肌AT1R蛋白表达明显上调[(49.8±14.1)、(52.6±15.8)vs(13.0±5.0)，P＜0.05]；热打击对AT2R蛋白表达无影响[(14.1±6.2)、(16.8±7.3)vs (9.8±4.5)，P＞0.05]。结论重症中暑早期能够导致大鼠心肌肾素-血管紧张素系统显著激活。

Wistar大鼠；中暑；心肌；肾素-血管紧张素

大量的基础研究表明，在心肌组织中存在包括肾素、血管紧张素原、血管紧张素转化酶等成分在内的肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)。在各种因素的作用下，可以在局部合成血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)，并发挥多种生理学效应。已有研究证明，在包括颅脑外伤、心肌梗塞、烧伤应激等多种动物模型中血浆血管紧张素Ⅱ水平显著升高，局部心肌组织中肾素、血管素Ⅱ及血管紧张素Ⅱ-1型受体(AngiotensinⅡtype 1 receptor，ATlR)表达升高。一定范围内的RAS激活对机体有积极的适应意义，而持久的激素水平增高则是有害的。目前对于重症中暑后心肌局部RAS变化的研究少见报道。本研究建立大鼠热打击模型，观察大鼠在热打击后血浆及心肌局部RAS的改变，为临床对于重症中暑的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备及大鼠分组 由于雌激素对热打击具有保护效应[1]，本实验均采用成年雄性大鼠。热打击模型的建立方法：腹腔注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉，分离左侧股动、静脉，股动脉置入24 G套管针连接压力转换器，监测有创动脉血压及脉搏。大鼠放入人工热气候模拟舱，舱内干球温度(36.5±0.5)℃，湿度(60±5)%，每15 min用肛温表测大鼠肛温并记录存活时间。取肛温达到42.0℃，并且平均动脉压(MAP)从峰值下降25 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)即为重症中暑模型[2-3]。实验选用健康雄性Wistar大鼠24只，体质量200～250 g。按随机数表法将大鼠分为正常对照组、热打击后2 h组(于热打击模型建立后常温复温2 h)、热打击后24 h组(于热打击模型建立后常温复温24 h)。每组各8只。对照组大鼠置于常温(25.0±0.5)℃，湿度(35±5)%的环境中。

1.2 血浆及心肌肾素(RA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平测定 大鼠腹主动脉取血3 mL迅速注入含酶抑制(EDTA)的抗凝管中，迅速分离血浆，低温冰箱保存。动物处死后取100 mg左心室心肌组织加入上述酶抑制剂溶液匀浆，离心，取上清液低温保存。血浆及心肌组织均采用竞争放射免疫分析法测定RA、AngⅡ水平。计算按操作说明书进行。

1.3 心肌血管紧张素Ⅱ-1、2型受体(AngiotensinⅡtype 1、2 receptor，AT1R、AT2R)蛋白表达水平测定 动物处死后快速取少量心尖部心肌，置于10%甲醛溶液固定24 h。梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋切片。Leica RM2016切片机。常规脱蜡，梯度酒精至水，行免疫组化染色。依次滴加一抗(抗体稀释度均为1:50，试剂购自Santa Cruz公司)、二抗及DAB显色系统。封片镜检。采用上海求为生物科技有限公司MIQAS医学图象定量分析系统进行图像分析。每个标本取三个视野。计算平均每个视野中阳性表达面积占整个视野面积的比值。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 热打击大鼠中心体温及血压变化 大鼠热打击后肛温逐渐上升，在约60 min达到42℃。大鼠热打击后MAP呈小幅度逐渐上升，45～70 min MAP迅速升高至160 mmHg左右，此后MAP呈下降趋势。在约77 min降低25 mmHg左右，此时即为重症中暑造模发生时间。

2.2 各组血浆和心肌RA、AngII水平比较 三组间血浆和心肌RA、AngⅡ差异有统计学意义(P＜0.05)。多重比较显示：与对照组比较，热打击后2 h组大鼠血浆和心肌RA、AngⅡ显著升高(P＜0.05)，热打击后24 h组大鼠血浆和心肌RA、AngII亦有明显升高(P＜0.05)。与热打击后2 h组比较，热打击后24 h组大鼠血浆和心肌RA、AngⅡ明显降低(P＜0.05)，见表1。

2.3 各组心肌AT1R、AT2R蛋白表达水平 三组间心肌AT1R差异有统计学意义(P＜0.05)。多重比较显示：与对照组比较，热打击后2 h组大鼠心肌AT1R表达显著上调(P＜0.05)，热打击后24 h组大鼠心肌AT1R表达亦显著升高(P＜0.05)。与热打击后2 h组比较，热打击后24 h组大鼠心肌AT1R表达仍处于高水平，差异无统计学意义(P＞0.05)。热打击后心肌AT2R表达有增高趋势，但三组间AT2R差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 各组血浆和心肌RA、AngII水平比较(±s)

表1 各组血浆和心肌RA、AngII水平比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与热打击后2 h组比较，bP＜0.05。

组别 只数 血浆心肌热打击后2 h组热打击后24 h组对照组F值P值888 RA[ng/(L·h)] 2237.0±173.2a1498.0±172.3ab785.4±43.2 132.139＜0.01 AngⅡ(ng/L) 143.4±19.8a76.8±21.6ab42.8±8.6 78.429＜0.01 RA[pg/(g·h)] 10.63±0.59a8.49±0.92ab1.66±0.38 91.954＜0.01 AngⅡ(pg/g) 279.9±11.3a212.5±10.1ab39.6±6.3 2839.115＜0.01

表2 各组心肌AT1R、AT2R蛋白表达水平比较(±s)

表2 各组心肌AT1R、AT2R蛋白表达水平比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05。

组别 只数AT1R(%)AT2R(%)热打击后2 h组热打击后24 h组对照组F值P值888 49.8±14.1a52.6±15.8a13.0±5.0 26.017＜0.01 14.1±6.2 16.8±7.3 9.8±4.5 3.407 0.052

3 讨 论

随着全球气温增高，重症中暑发病率逐年增高。热打击作为一种主要的应激源扮演着重要的角色[4]。心脏是热打击下机体最先和最易受到损伤的部位[5]。热打击所致的心肌损伤近年来越来越受到重视，但对于其发病机制目前仍不明确[6-7]。研究表明，热打击所致的心肌损害有其特点。热打击可引起广泛的心肌细胞水肿、变性、坏死等。而这些病理损伤与体温升高的持续时间、程度等直接相关。随着热打击的持续时间延长和程度的加剧，心肌的损害由开始的可以逆性逐渐发展为不可逆性损害。此时，即使脱离高温环境心肌的损害仍然会继续进展[5-6]。因此，热打击所致的心肌损害一直是国内外学者研究的热点之一。对于其复杂的机制及临床防治方法尚不甚明确。现已明了，肾素-血管紧张素系统(RAS)是机体的重要应激激素反应系统之一。而血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性肽，它是通过与AT受体结合发挥作用。过去认为，血管紧张素Ⅱ的生物活性类似于大多数内分泌因子是通过血液循环到达靶器官和组织。随后的基础和临床研究发现，在体内包括心脏、肾脏等多种器官和局部组织也存在RAS。局部产生的AngⅡ可能起着自分泌、旁分泌和胞内分泌的作用[8]，这种作用在正常生理条件下的意义并不十分明确。然而大量的研究发现心脏局部RAS在一些疾病的发生发展过程中有着十分重要的病理生理意义。有证据显示心脏局部RAS在心肌梗死及再灌注损伤等缺血性心脏病、心功能不全、心力衰竭、烧伤等多种病理过程中起着重要的作用[9-10]。

本实验中观察了热打击后血浆及心肌局部RA及AngⅡ的变化。结果显示，热打击后大鼠血浆及心肌RA、AngⅡ显著升高。这说明作为应激反应的重要组成部分，RAS在热打击后迅速被激活，同时作为循环的重要调节系统，心肌局部RAS也在热打击早期迅速被激活。需要注意的是，本实验中热打击后24 h心肌RAS的激活水平虽然仍较高，但相对于热打击后2 h却显示出迅速下降的趋势。热打击时循环与组织AngⅡ增高在一定范围内对机体有积极的防御意义，而持久的血浆与组织AngⅡ增多则可能带来不利影响。研究发现，心肌局部RAS主要参与心肌局部血管紧张性和血流量的调节，并增加交感神经末梢释放儿茶酚胺，促进血管内皮素释放以及对心肌收缩功能的调节[9]。文献报道局部增多的AngⅡ直接或刺激交感神经而增强对冠脉和心肌的收缩作用，使心脏做功加强但心肌供血却相对不足，心肌氧耗增加而氧供却减少，以致能量耗竭，细胞的钙转运能力下降，不能有效地将钙转运至肌浆网和胞外，造成细胞内钙超载，胞内蓄积的钙在线粒体与氧化磷酸化竞争能量，使呼吸链功能更加紊乱[11]，从而加重心肌损伤。此外，过量的AngⅡ还可以通过引起冠脉的收缩使得冠脉循环障碍，内皮细胞受损及自由基产生增多，对机循环系统等带来不利的影响[12]。但是其他具体机制仍不清楚。研究认为，病理状态下RAS激活造成的心肌损伤主要集中在其促进氧化应激损伤方面。ROS是一种具有高度活性的非特异性分子。在生理情况下所产生的活性氧，可以被机体利用并发挥重要的生理功能。但在病理情况下，氧化应激增强，则可以造成生命大分子物质的氧化损伤、钙稳态失衡及引发细胞凋亡，从而造成心肌损伤。

目前认为AngⅡ的经典生物学作用由AT1R介导，其效应主要有血管收缩、心肌肥厚和细胞外基质增生、增加醛固酮释放、介导炎症及氧化应激反应等。本研究中热打击后大鼠心肌AT1R表达显著上调。这显然使得RAS能迅速参与到热打击后机体的应激反应当中。AT2R的功能尚未完全清楚，目前的研究结果认为AT2R具有拮抗AT1R的功能，AT2R可能和酪氨酸激酶相偶联，引起血管扩张、抗平滑肌细胞增殖、促进细胞凋亡等效应。也就是说，AT2R介导了拮抗AT1R的生物学效应，两者处于动态平衡之中[13-14]。本研究中热打击后心肌AT2R表达虽组间差异无统计学意义，但仍能看出有升高的趋势。AT2R/AT1R比值有所上升。提示AT2R通过拮抗AT1R发挥潜在的心脏保护作用在热打击后的短时间内尚不能充分发挥出来。大量研究表明，在包括心力衰竭、心肌梗死在内的多种疾病中均可以见到AT2R表达上调，AT2R/AT1R上升[15-16]。占优势地位的AT2R与AngⅡ结合激活，从而改善心脏功能，对于心脏是一种内源性保护机制。但是这些研究提示这种AT2R表达的上调均发生于24 h之后，乃至更晚[17]。本实验中观察到心肌AT1R与AT2R在热打击后表现出相反的变化趋势，是与既往研究结果相符合的。并且进一步证实了AT2受体与AT1受体在热打击中介导了不同的反应。

综上所述，在病理状态下，RAS作为应激反应系统之一，发挥了机体保护作用，但同时其过度激活也对机体带来一定的损伤作用。心血管系统是RAS调控的主要靶点，也是其损伤作用的突出表现所在。心肌局部存在的RAS在重症中暑后迅速被激活，早期的激活可能对机体维持自身内环境的稳定有一定的作用，但随着时间的延长，其激活程度有所下降，从而限制了心脏的进一步损伤。其机制尚不明确。可能与AT2R和AT1R在热打击中表现出不同的变化趋势从而介导了不同的机体反应有关。对于RAS系统各成分及相应受体的变化的具体机制还需要在今后的实验中进一步研究。

[1]Chen SH,Chang FM,Niu KC,et al.Resuscitation from experimental heatstroke by estrogen therapy[J].Crit Care Med,2006,34(4): 1113-1118.

[2]Tong H,Wan P,Zhang X,et al.Vascular endothelial cell injury partly induced by mesenteric lymph in heat stroke[J].Inflammation,2014,37 (1):27-34.

[3]Chen SH,Chang FM,Chang HK,et al.Human umbilicalcord blood-derived CD34+cells cause attenuation of multiorgan dysfunction during experimental heat stroke[J].Shock,2007,27(6):663-671.

[4]Atha WF.Heat-related illness[J].Emerg Med Clin North Am,2013, 31(4):1097-1108.

[5]Chen WT,Lin CH,Hsieh MH,et al.Stress-induced cardiomyopathy caused by heat stroke[J].Ann Emerg Med,2012,60(1):63-66.

[6]Nakagawa Y,Inoue H,Shinone K,et al.Molecular biological analysis of cardiac effect of high temperature in rats[J].Leg Med(Tokyo), 2012,14(2):63-68.

[7]Muñiz AE.Ischemic electrocardiographic changes and elevated troponin from severe heatstroke in an adolescent[J].Pediatr Emerg Care, 2012,28(1):64-67.

[8]Lee MA,Böhm M,Paul M,et al.Tissue renin-angiotensin systems. Their role in cardiovascular disease[J].Circulation,1993,87(5 Suppl):IV7-13.

[9]De Mello WC,Frohlich ED.On the local cardiac renin angiotensin system.Basic and clinical implications[J].Peptides,2011,32(8): 1774-1779.

[10]De Giusti VC,Caldiz CI,Ennis IL,et al.Mitochondrial reactive oxygen species(ROS)as signaling molecules of intracellular pathways triggered by the cardiac rennin-angiotensin II-aldosterone system (RAAS)[J].Front Physiol,2013,4:126.

[11]Esme H,Fidan H,Koken T,et al.Effect of lung ischemia-reperfusion on oxidative stress parameters of remote tissues[J].Eur J Cardiothorac Surg,2006,29(3):294-298.

[12]Tapuria N,Kumar Y,Habib MM,et al.Remote ischemic preconditioning:a novel protective method from ischemia reperfusion injury-a review[J].J Surg Res,2008,150(2):304-330.

[13]Horiuchi M,Iwanami J,Mogi M.Regulation of angiotensinⅡreceptors beyond the classical pathway[J].Clin Sci(Lond),2012,123(4): 193-203.

[14]Unger T,Culman J,Gohlke P.AngiotensinⅡreceptor blockade and end-organ protection:pharmacological rationale and evidence[J].J Hypertens Suppl,1998,16(7):S3-S9.

[15]Oishi Y,Ozono R,Yano Y,et al.Cardioprotective role of AT2 receptor in postinfarction left ventricular remodeling[J].Hypertension, 2003,41(3 Pt 2):814-818.

[16]Bove CM,Yang Z,Gilson WD,et al.Nitric oxide mediates benefits of angiotensinⅡ type 2 receptor overexpression during post-infarct remodeling[J].Hypertension,2004,43(3):680-685.

[17]Busche S,Gallinat S,Bohle RM,et al.Expression of angiotensin AT (1)and AT(2)receptors in adult rat cardiomyocytes after myocardial infarction.A singl-cell reverse transcriptase-polymerase chain reaction study[J].Am J Pathol,2000,157(2):605-611.

Effect of severe heatstroke on local cardiac renin angiotensin system in rats.

QU Ting1,ZHENG Wei-hong1,LU Cheng-xiang2.Department of Neurology1,Intensive Care Unit2,Zhongshan Hospital Xiamen University,Xiamen 361004, Fujian,CHINA.

ObjectiveTo investigate the effects of severe heatstroke on rat cardiac renin angiotensin system (RAS).MethodsA total of 24 male Wistar rats were randomly divided into control group,2 hours after severe heatstroke group and 24 hours after severe heatstroke group,with 8 rats in each group.Renin activity(RA)and angiotensinⅡ(AngⅡ)in plasma and myocardium were determined with radioimmunoassay.Cardiac angiotensinⅡtype 1,2 receptor(AT1R,AT2R)protein levels were examined by immunohistochemical method.ResultsAfter 60 minutes of heatstroke,rectal core temperature of rats reached 42℃or above,and mean arterial pressure decreased to 25 mmHg after 77 minutes.When these conditions meet the requirements,the severe heatstroke model was successfully established.Com-pared with control group,2 and 24 hours after heat stroke groups had significantly higher RA and AngⅡin plasma and myocardium[plasma RA:(2237.0±173.2),(1498.0±172.3)vs(785.4±43.2),P＜0.05;plasma AngⅡ:(143.4±19.8),(76.8± 21.6)vs(42.8±8.6),P＜0.05;myocardium RA:(10.63±0.59),(8.49±0.92)vs(1.66±0.38),P＜0.05;myocardium AngⅡ: (279.9±11.3),(212.5±10.1)vs(39.6±6.3)P＜0.05];Compared with 2 hours after heat stroke groups,24 hours after heat stroke groups had significantly lower RA and AngⅡin plasma and myocardium[plasma RA:(2 237.0±173.2)vs(1 498.0± 172.3),P＜0.05;plasma AngⅡ:(143.4±19.8)vs(76.8±21.6),P＜0.05;myocardium RA:(10.63±0.59)vs(8.49±0.92),P＜0.05;myocardium AngⅡ:(279.9±11.3)vs(212.5±10.1),P＜0.05].Compared with control group,AT1R protein levels notably increased in 2 and 24 hours after heat stroke groups[(49.8±14.1),(52.6±15.8)vs(13.0±5.0),P＜0.05].No apparent changes were observed in AT2R protein level[(14.1±6.2),(16.8±7.3)vs(9.8±4.5),P＞0.05].ConclusionHeat stroke can significantly activate renin angiotensin system in both plasma and myocardium in rats in the early stage.

Wistar rat;Heat stroke;Myocardium;Renin-angiotensin

R-332

A

1003—6350（2016）12—1905—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.004

2015-12-22)