NPPB基因多态性与海南黎族原发性高血压相关性研究

范美竹，云美玲，周代锋，李天发，黄珊，李继科，欧阳鹏飞

(1.贵阳中医学院研究生院，贵州 贵阳 550002；2.海南医学院附属医院心内科，海南 海口 570102；3.海南医学院生物化学教研室，海南 海口 571101)

·论 著·

NPPB基因多态性与海南黎族原发性高血压相关性研究

范美竹1，云美玲2，周代锋3，李天发2，黄珊2，李继科2，欧阳鹏飞1

(1.贵阳中医学院研究生院，贵州 贵阳 550002；2.海南医学院附属医院心内科，海南 海口 570102；3.海南医学院生物化学教研室，海南 海口 571101)

目的 探讨脑钠肽基因(NPPB)的RS3753581突变位点与海南黎族人原发性高血压发病的相关性。方法采用特异性等位基因PCR方法对海南626例黎族高血压病患者(观察组)及616例黎族健康人(对照组)的NPPB基因RS3753581突变位点进行多态性检测。采用SPSS16.0统计学软件分析两组基因型频率以及等位基因频率。结果观察组突变位点RS3753581的CC、CA、AA基因型的频率分布分别为89.7%(562/626)、7.5%(47/626)、2.8%(17/626)，对照组分别为98.0%(604/616)、1.0%(6/616)、1.0%(6/616)，两组比较差异有统计学意义(χ2=7.206，P=0.027＜0.05)。观察组C、A等位基因频率分别为93.5%(1 170/1 252)、6.5%(82/1 252)，对照组分别为98.5%(1 214/1 232)、1.5%(18/1 232)，两组比较差异有统计学意义(χ2=6.885，P=0.009＜0.05)。结论脑钠肽基因突变位点RS3753581多态性与海南黎族人高血压病具有相关性。

黎族；原发性高血压病；基因多态性；相关性

原发性高血压(Primary hypertension)是高血压的一类，其占高血压的比例大于95%。众多研究认为高血压病是遗传和环境因素共同引起的与多种基因表达相关的遗传性疾病，其发病具有显著家族聚集性[1]，其遗传机制是一种微效基因作用模式，即主要通过性状数量遗传模式的剂量-效应关系，达到发病阈值，再联合环境因素作用，之后导致原发性高血压发病。由于分子生物学、生物信息技术学发展迅速，从基因的角度研究原发性高血压发病机制是医学研究热点[2]。

海南地处中国的热带区域，黎族人群是海南原住居民，由于自然地理位置的隔断和黎族比较封闭保守的婚恋原则，导致黎族基因与汉族基因之间的迁移较少，一定程度上造成了黎族基因的保守性，从而使黎族基因具有其独特性。再者，原发性高血压也是黎族除地中海贫血之外的聚集性疾病之一。本文旨在研究海南黎族原发性高血压与脑钠肽基因(Brain natriuretic peptide，BNP)[3]RS3753581位点多态性的相关性，从基因水平上探讨遗传因素在原发性高血压发病中的地位和作用[4]，以期为对高血压人群的筛选，及早识别原发性高血压高危人群提供新的有力理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年6月至2015年6月从海南省陵水黎族自治县人民医院随机选取海南籍黎族高血压患者626例作为观察组，所有患者的高血压病诊断均符合2010年《中国高血压防治指南》[5]中的诊断标准；选取同时期海南籍黎族健康居民616例作为对照组。提取所有研究对象静脉血6 mL，按SDS法提取DNA。

1.2 特异等位基因PCR扩增

1.2.1 引物设计与合成 从Ensemble datebase中获得NPPB基因序列，采用Primer5.0破解版软件进行引物设计，并由上海生物工程有限公司进行合成，见表1。

表1 特异性等位基因PCR的引物序列及扩增片段长度

1.2.2 PCR反应条件 80 μL反应体系中DNA模板(10ng/μL)8μL，上下游引物各4μL，1×TaqPCRMast。

1.2.3 PCR扩增PCR反应条件 Mix 40 μL，ddH2O24 μL，94℃预变性3.5 min；94℃变性35 s；60℃退火35 s；72℃延伸35 s，34个循环；72℃延伸3.5 min。之后委托上海生物工程有限公司进行序列测定。利用Chroma软件读取测序图。

1.3 统计学方法 对基因型频率、等位基因频率数据应用SPSS16.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组受检者一般资料比较 两组受检者的体质量指数(BMI)、血压、甘油三酯(TG)、心率等比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.2 分型结果 黎族高血压患者基因组PCR扩增电泳图见图1。

图1 RS3753581突变位点基因分型PCR扩增电泳图

表2 两组受检者一般资料比较(±s)

表2 两组受检者一般资料比较(±s)

注：1 mmHg=0.133 kPa。

组别观察组对照组t值P值例数626 616 BMI(kg/m2) 23.25±2.05 24.31±2.08 28.056 0.590 SBP(mmHg) 151.85±29.62 112.13±19.44 14.212 0.001 DBP(mmHg) 86.66±16.48 74.76±10.52 62.394 0.000 TG(mmol/L) 3.81±1.25 1.33±0.87 4.212 0.003心率(次/min) 82.4±18.13 82.10±18.4 64.054 0.000

2.3 测序结果 观察组的测序结果验证见图2～图4，对照组的测序结果验证见图5～图7。

2.4 两组受检者的NPPB基因RS3753581多态位点比较 观察组中可检测出CC、CA、AA三种基因型，频率分布分别为89.7%(562/626)、7.5%(47/626)、2.8%(17/626)；对照组可检测出CC、CA、AA三种基因型，频率分布分别为98.0%(604/616)、1.0%(6/616)、1.0%(6/616)，两组比较差异有统计学意义(χ2=7.206，P=0.027＜0.05)。观察组C、A等位基因频率分布分别为93.5%(1 170/1 252)、6.5%(82/1 252)，对照组C、A等位基因频率分布分别为98.5%(1 214/1 232)、1.5% (18/1 232)，两组比较差异有统计学意义(χ2=6.885，P= 0.009＜0.05)。

图2 RS3753581突变位点(210)基因分型样本的测序：CC基因型，测序的阴性图谱

图3 RS3753581突变位点(206)基因分型样本的测：CA基因型，测序的阳性图谱

图4 RS3753581突变位点(231)基因分型样本的测序：AA基因型，测序的阳性图谱

图5 RS3753581突变位点(228)基因分型样本的测序：CC基因型，测序的阴性图谱

图6 RS3753581突变位点(201)基因分型样本的测序：AA基因型测序的阳性图谱

图7 RS3753581突变位点(206)基因分型样本的测序：CA基因型，测序的阳性图谱

3 讨 论

原发性高血压是以体循环动脉压升高为主要表现的心血管综合征。高血压病对心脑肾周围动脉等靶器官均造成损害，如在所有高血压患者中，有20%～30%可查到左室肥厚，轻度高血压患者发生左心室肥厚机率比正常血压增多2～3倍，而重度高血压可达10倍[6-7]。高血压是冠心病的主要危险因素之一，高血压病患者患冠心病的危险是正常者的2倍，长期高血压不治疗，有50%死于冠心病。肾脏参与高血压的形成与维持，反过来，肾脏又因血压升高而损害，长期高血压没有治疗，可引起终末期肾功能衰竭，或加速肾实质的破坏导致原发或继发的肾脏疾病。

NPPB在心室和心房均可表达，主要表达在心室，脑钠肽受基因转录表达水平调控。因此，NPPB基因多态性可能对BNP的转录、合成及分泌产生作用。有研究表明基因位点的几种常见变异与血循环中的利钠肽浓度紧密相关，引发不同个体间血压的差异以及高血压。

本实验结果显示，两组患者CC、CA、AA基因型的频率分布比较差异有统计学意义(χ2=7.206，P=0.027＜0.05)，说明该位点突变与否与黎族人高血压病密切相关；而C、A等位基因频率分布比较差异也有统计学意义(χ2=6.885，P=0.009＜0.05)，说明该位点多态性与海南黎族人群原发性高血压发病风险具有相关性。

由于本实验采用的是等位基因特异性PCR方法，且研究对象数量有限，NPPB基因RS3753581多态性位点是否与原发性高血压的发病有明显相关性，是否可作为我国黎族人群原发性高血压发生的遗传学标志，还有待于大样本病例对照实验加以验证。同时还需进一步对NPPB基因上的RS3753581位点进行功能性研究，更加深入探讨RS3753581位点多态性参与原发性高血压发生发展的可能生物学机理。

[1]Hauser ER,Mooser V,Crossman DC,et al.Design of the genetics of early onset cardiovascular disease(GENECARD)study[J].Am Heart J,2003,145(4):602-613.

[2]Newton-Cheh C,Larson MG,Vasan RS,et al.Association of ommonvariants in NPPA and NPPB with circulating natriuretic peptides and blood pressure[J].Nat Genet,2009,41(3):348-353.

[3]党连生,徐燕,刘美玲,等.BNP水平与原发性高血压严重程度相关性研究[J].现代预防医学,2012,39(6):1558-1561.

[4]Lahiri DK,Schnabel B.DNA isolation by a rapid method from human blood samples:effects of MgCl2,EDTA,storage time,and temperature on DNA yield and quality[J].Biochem Genet,1993,31(7-8): 321-328.

[5]中国高血压防治指南修订委员会.中国高血压防治指南[J].中华心血管病杂志,2011,39(7):579-616.

[6]Tsutamoto T,Wada A,Maeda K,et al.Attenuation of compensation of endogenous cardiac natriuretic peptide system in chronic heart failure:prognostic role of plasma brain natriuretic peptide concentration in patients with chronic symptomatic left ventricular dysfunction [J].Circulation,1997,96(2):509-516.

[7]Gruchala M,Ciecwierz D,Wasag B,et al.Association of the Sca I atrial natriuretic peptide gene polymorphism with nonfatal myocardial infarction and extent of coronary artery disease[J].Am Heart J, 2003,145(1):125-131.

Study on the relationships between NPPB gene polymorphisms and primary hypertension of Li Nationality in Hainan.

FAN Mei-zhu1,YUN Mei-ling2,ZHOU Dai-feng3,LI Tian-fa2,HUANG Shan2,LI Ji-ke2,Ouyang Peng-fei1. 1.Graduate School of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,Guizhou,CHINA;2.Department of Cardiovascular,Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA;3.Department of Pathology,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between brain natriuretic peptide gene(NPPB) RS3753581 and primary hypertension of Li Nationality in Hainan.MethodsA total of 626 patients with hypertension (observation group)and 616 healthy people(control group)were detected for NPPB gene polymorphisms by allele-specific polymerase chain reaction(PCR).Genotype frequency and allele frequency of the two groups were analyzed by SPSS16.0 statistical software.ResultsThe CC,CA,AA genotype frequency distribution of RS3753581 were 89.7% (562/626),7.5%(47/626),2.8%(17/626)respectively in the observation group,and 98.0%(604/616),1.0%(6/616), 1.0%(6/616)respectively in the control group,with statistically significant difference between two groups(χ2=7.206，P= 0.027＜0.05).The allele frequency of C,A were 93.5%(1170/1252),6.5%(82/1252)in the observation group,and 98.5%(1214/1232),1.5%(18/1232)in the control group,with significant difference between two groups(χ2=6.885,P= 0.009＜0.05).ConclusionNPPB gene RS3753581 polymorphisms are associated with primary hypertension of Li Nationality in Hainan.

Li Nationality;Primary hypertension;Gene polymorphism;Relationship

R544.1

A

1003—6350（2016）12—1893—03

2016-03-14)

海南省自然科学基金项目(编号：80586)；海南省教育厅重点科研资助项目(编号：HjKj2008-43)；海南省海口市重点科技计划项目(编号：2013-53)

云美玲。E-mail：yunmeiling518@163.com