卵巢冷冻移植的发展历程及研究现状

范东青，张璨，胡艳秋

卵巢冷冻移植的发展历程及研究现状

范东青，张璨，胡艳秋△

女性生育力保存的方式包括胚胎冷冻、卵子冷冻及卵巢冷冻移植。胚胎冷冻技术相当成熟，玻璃化冷冻胚胎存活率已达90%以上，卵子冷冻也取得了一定进展，相较于前两种保存生育力的方法，卵巢冷冻移植不仅能够保存生殖功能，也有望保存内分泌功能。目前人类卵巢移植主要包括新鲜或冷冻卵巢组织的原位或异位移植。卵巢移植的影响因素包括冷冻保存过程、移植部位及移植前预处理等。随着器官冷冻技术及显微外科技术的完善，整体卵巢冷冻移植逐渐成为卵巢保存的发展方向。但整体卵巢移植尚处于动物实验阶段，人整体卵巢冷冻保存处于探索阶段，尚无统一的冷冻及解冻程序。综述了卵巢冷冻保存及移植的发展历程及研究现状。

卵巢；低温保存；冷冻；移植，自体

【Abstract】Themethods of female fertility preservation includes embryo cryopreservation，occyte freezing and ovarian tissue cryopreservation.The embryo freezing technology has been well developed with the survival rate over 90%.The oocyte freezing technology has also yielded progress in recent years.The ovarian tissue cryopreservation and transplantation has a predominance in the preservation of both endocrine function and reproductive function.Currently，human ovarian transplantation mainly consists of the orthotopic and heterotopic transplantation of fresh or cryopreserved ovarian tissue.The factors related to ovarian transplantation include the process of cryopreservation，transplantation site and pretreatment before transplantation，etc.With the increasingly improved technology of organ freezing and microsurgery，cryopreservation and transplantation of whole ovary have been the trend of ovarian preservation.However，the whole ovary transplantation is still at the stage of animal experiments.There are not the standard procedure of cryopreservation and thawing.The research progress of ovarian cryopreservation and transplantation was reviewed.

【Keyw ords】Ovary；Cryopreservation；Freezing；Transplantation，autologous

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：405-408）

近年来关于女性生育力的保存备受关注，有研究指出，女性生育力特别是35岁以上的女性生育力随着年龄递增而降低。玻璃化冷冻胚胎为许多生育力降低的女性带来了福音［1］。随着医学技术的发展，癌症患者5年生存率升高［2-3］，尤其小于40岁的女性癌症患者比例逐渐升高［4］，但治疗癌症的方法诸如放化疗对女性的卵巢功能也产生了不同程度的损伤，如何保存此类女性的卵巢功能成为很多学者关注的热点。卵巢保存移植不受女性年龄、有无配偶、道德伦理等限制，也为子宫内膜异位症患者及急性良性妇科疾病［5］（如卵巢蒂扭转）患者提供了保存生育力的方案。

20世纪90年代，随着冷冻科学技术的发展和改进以及各种抗冻剂的出现，卵巢组织冷冻发展非常迅速，不断有小鼠、兔子、绵羊和非人类哺乳类动物卵巢组织冷冻实验研究报道，并有冻融卵巢组织移植成功的案例。关于人类卵巢组织保存及移植的试验也正进行中，研究表明，人的卵巢组织能够耐受低温冷冻，卵巢皮质组织在冻融前后外观及卵泡发展阶段并没有区别，卵泡闭锁比例也未见明显不同［6-7］。2004年Donnez等［8］报道了采用程序化冷冻方法保存卵巢组织，解冻后自体原位移植，术后半年就恢复了月经周期，并有周期性排卵及黄体生成，最终患者获得了成功妊娠并顺利分娩，这说明了人类卵巢移植的可行性。

1　卵巢移植的主要类型、特点

1.1根据供受体关系

1.1.1自体移植不受到免疫排斥反应的影响，手术后的并发症相对少，自体移植能恢复女性的正常月经，维持女性正常激素水平，迄今为止自体移植已经取得了很大发展。通过卵巢移植，一般卵巢功能可维持12个月，有些甚至持续了4～5年［9-10］。①自体异位移植：主要是带血管蒂的卵巢组织移植和无血管的卵巢组织切片移植。自体异位移植在临床实践中现已经被应用，并且术后预后很好［10］。②自体原位移植：自体原位移植最大的优点是可以基本保存自然的组织结构和生殖功能。人类原位移植的研究主要是将卵巢移植到卵巢皮质下和卵巢所在部位腹膜下。2015年1例28岁葡萄牙女性接受冷冻10年卵巢组织进行自体原位移植，术后通过卵巢刺激方案获得2个卵子，并成功获得1枚胚胎［11］。

1.1.2同种异体移植其面临的最大难题就是免疫排斥反应，其次是供体提供者的问题。在人卵巢组织的异体移植中，因供体卵巢组织的来源受到限制，以及目前抗排斥的免疫药物的毒性、不良反应等诸多因素，使得卵巢组织的异体移植在临床实践中受到限制。国外学者将研究方向专注于同卵双胞胎姐妹间及具有血缘关系的亲属之间的卵巢移植，2009年Silber［12］对10对一方患有卵巢功能早衰的双胞胎进行了新鲜卵巢组织移植及整体卵巢移植，结果有10次自然妊娠，最终7例健康婴儿出生，其中带血管蒂吻合的整体卵巢移植的患者，术后卵泡刺激素（FSH）及黄体生成激素（LH）水平在所有卵巢移植患者中最低，在移植后2年成功妊娠并分娩一婴儿。1.1.3异种移植有更强烈、迅猛的免疫排斥反应。有研究将人类冻融卵巢组织移植到免疫缺陷小鼠，移植后小鼠出现了一系列生理过程，包括原始卵泡、窦卵泡正常的形态、黄体生成及MⅡ期卵母细胞的出现［13-16］。异种移植现仅处于实验研究阶段，带有免疫缺陷基因的啮齿类动物（如鼠类）是人类卵巢组织皮质异种移植材料。

1.2根据卵巢是否完整

1.2.1卵巢皮质组织移植Oktay等［9］、Bagis等［17］研究表明，卵巢皮质组织移植新血管形成期间的局部缺血可持续3～7 d，在此期间50%或更多的原始卵泡和几乎所有生长中卵泡都会消失。这缩短了移植后的卵巢组织具有功能的时间，因而限制了冻融卵巢组织片段的临床应用。

1.2.2整体卵巢移植2006年Imhof等［18］通过微血管吻合术对冻融后绵羊整体卵巢行原位自体移植，其中1只绵羊在移植术后1年获得自然妊娠并活产1只健康小羊。2009年Silber［12］的研究中，接受整体卵巢移植的女性在移植后成功妊娠，并足月分娩。2014年Campbell等［19］研究表明，采用低温冷藏及移植术后优化抗凝机制技术，整个卵巢冷冻后再自体移植的成年绵羊全部恢复了卵巢功能，其自然妊娠率64%，活产率29%。冷冻保护剂灌注时间及灌注速率对卵巢功能恢复起关键作用。可以认为，带有血管蒂整体卵巢移植将成为未来的研究方向。

2　卵巢移植的影响因素

2.1冷冻保存过程卵巢组织的冷冻效果，与冷冻保护剂类型和浓度、卵巢组织大小、冷冻速度及脱水时间等有关。对于整体卵巢冷冻而言，还与冷冻保护液灌注速率、灌注时间有关。

2.1.1渗透性冷冻剂二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）和甘油（GLY），通过渗透细胞起到保护作用；Milenkovic等［20］用2种程序化冷冻方案［1.5mol/LDMSO和1.5mol/L林格醋酸盐（RA）］对羊整体卵巢的冷冻效果进行了比较，DMSO作为冷冻保护剂效果优于RA。

2.1.2卵巢组织块形态大小大多处理为厚约1 mm，表面积1mm2～1 cm2。Scott等［21］冷冻不同形状的人类卵巢组织，解冻后进行体外培养发现，立方体形的组织块第7天就出现较多的存活卵泡且卵泡生长较好，较其他形状的组织块更有优势。

2.1.3冷冻方式①慢速程序化冷冻：需要昂贵的程序化冷冻仪，耗时，可能破坏了卵巢组织蛋白的完整性，优点是可批量处理组织，技术相对成熟且已取得了显著成果。②玻璃化冷冻：简便、快捷、经济，避免了胞浆内冰晶形成，在保护颗粒细胞、胶原束、细胞间隙和始基卵泡等方面具有优势，但样本量较大时操作繁复、劳累。玻璃化冷冻还处于研究阶段，其安全性和有效性尚待进一步证实。

2.1.4冷冻载体体积小、传热快且安全的冷冻载体可提高冷冻效果。目前常用于冷冻卵巢组织的载体有2mL冷冻管、0.25mL标准麦管、铜网和Cryotop法等。Cryotop法使标本直接与液氮接触，较易发生生物污染；2mL冷冻管降温速度最慢，多用于慢速程序化冷冻。

2.1.5整体卵巢冷冻保护剂的灌注速率及灌注时间

Isachenko等［22］测定了牛整体卵巢的不同灌注速率对冷冻效果的影响，结果发现以0.83m L/min、0.42 mL/min灌注60min效果最好。

2.2移植部位

2.2.1异位移植肌肉内移植、肾被膜下移植及皮下移植三者比较，皮下移植的血管周围细胞和卵泡完整性受损情况最重，肾被膜下移植次之；移植物回收率和卵泡存活率也逐渐降低。

2.2.2原位移植部位靠近输卵管，若移植效果良好，可能自然受孕。2011年Janse等［23］对接受化疗的癌症患者进行了卵巢皮质组织原位移植，最终患者成功妊娠并顺利分娩一婴儿。

2.3移植前预处理

2.3.1抗氧化作用氧化作用会对细胞膜、内皮细胞膜、线粒体膜造成损害。减少缺血-再灌注过程中的过量活性氧生成，可以防止移植物功能恢复延迟和功能早衰，抗氧化剂如抗坏血酸、甘露醇、氧四环素、褪黑素、维生素C、维生素E，能减轻一定的血管内皮损伤。

2.3.2加快促使新血管形成①生长因子因素能诱导血管形成，如纤维母细胞生长因子、转化生长因子和血管内皮生长因子（VEGF）。局部应用VEGF较系统使用VEGF可能更有效。②氨醇磷酸酯能促进卵巢移植物中血管的生成，能减轻组织的缺血再灌注损伤［24］。③移植前催生肉芽组织可以减少缺血损伤。卵巢移植炎症反应可以促进血管再生。

2.3.3激素在卵巢组织移植过程中，促性腺激素（Gn）的处理时间和处理部位对卵泡的存活具有重要调节作用。Imthurn等［25］研究发现，在移植前后2 d注射Gn，可使移植组织中的卵泡数量明显增多，其作用机制可能是通过上调血管生成因子来发挥作用。Maltaris等［26］认为移植后短时间给予外源性Gn可促进血管再生，而长时间给予会导致始基卵泡消耗增加。目前，移植前后应用Gn尚无统一结论。

3　目前遇到的问题及其发展前景

卵泡数量是最直接反映卵巢储备功能的一个指标。减少冷冻复苏过程中卵泡的损伤在卵巢组织移植中尤为重要。缺血性损伤对原始卵泡生长及卵巢基质都有影响。早期一些关于无血管卵巢移植的研究中表明在新血管形成之前，有大量卵泡丢失。新血管形成的机制尚不明确。鉴于无血管卵巢组织移植血管重新生成时间较长，造成的缺血损伤大，近年有研究提出带血管蒂整体卵巢移植，在血管重建后迅速恢复血流，以有助于减轻缺血性的损伤，理论上带血管蒂的整体卵巢移植可通过直接对血管进行吻合而减少组织的缺血损伤，有望保存更多的卵泡而使卵巢功能得以长久维持。然而目前整体卵巢移植结果是卵泡密度显著降低，不管是冷冻还是未冷冻卵巢。原因在于卵巢含有各级卵泡和基质细胞，对冷冻保存条件要求不同，整个器官的保存缺乏标准方案，冷冻保护液没有完全浸透组织、血管重建技术有待提升。要获得整体卵巢冷冻移植的成功，需进一步解决上述问题。尽管尚未见整个卵巢冷冻移植的报道，但正在尝试的同卵双胞胎之间使用整体卵巢移植，能够恢复卵巢的功能［27］。还有学者提出卵巢组织移植合并卵泡体外培养来保存生育力，但这需要完善物种特异性培养体系、培养时间、培养液添加物/补充物的使用、氧气的最适浓度、培养后卵泡质量的评估等［28-29］。

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Ovary Cryopreservation and T ransp lantation

FAN Dong-qing，ZHANG Can，HU Yan-qiu.
Dalian Medical University，Dalian 116044，China（FAN Dong-qing，ZHANG Can）；Reproductive Center，Subei People's Hospital，Yangzhou 225001，Jiangsu Province，China（HU Yan-qiu）
Corresponding author:HU Yan-qiu，E-mail:yanqiuhu@yahoo.com

2016-05-13）

［本文编辑王昕］

116044大连医科大学（范东青，张璨）；苏北人民医院生殖中心（胡艳秋）

胡艳秋，E-mail：yanqiuhu@yahoo.com

△审校者