女性生育力保存技术的研究进展

李微，张娜

女性生育力保存技术的研究进展

李微，张娜△

近年女性生育力保存的问题引起人们的密切关注，其适用人群包括卵巢功能不全患者、肿瘤患者、自身免疫性疾病患者、欲将生育年龄延后的人群等。由于放化疗药物的使用造成女性生育力下降，严重影响了患者的生活质量，因此年轻的肿瘤患者可能成为生育力保存的主要目标人群。生育力保存的方式包括3种：胚胎冷冻、卵母细胞冷冻及卵巢组织冷冻。胚胎冷冻技术已经成功应用于临床，卵母细胞冷冻技术亦日趋成熟，但卵巢组织冷冻技术尚处于研究初始阶段，应用前景广泛。3种生育力保存方式均可采用慢速冷冻方法和玻璃化冷冻方法进行冷冻保存，2种方法各有优缺点。综述近年来对生育力保存的范围、方法及今后需要解决的问题，为进一步研究提供思路。

女（雌）性；生育力；低温保存；卵母细胞；肿瘤

【Abstract】The fertility preservation is suitable for those patientswith primary ovarian insufficiency，tumor，autoimmune disease，and those people who want to postpone parenthood.Young women with tumor will be the main population of fertility preservation because radiotherapy and chemotherapy always impaire their fertility and living quality.There are three kinds of fertility preservation technology:embryo freezing，oocyte freezing and ovarian tissue cryopreservation.The technology of embryo freezing has been successfully used in clinical practice. The technology of oocyte freezing is gettingmature.However，the technology of ovarian tissue cryopreservation is still at the early stage of research.Both of slow-freezingmethod and virtificationmethod can be applied in fertility preservation techniques，with own advantages and disadvantages.The paper mainly introduces the methods of fertility preservation and the problems needed to be solved.

【Keywords】Female；Fertility；Cryopreservation；Oocytes；Neoplasms

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：409-412）

由于生活环境及生活习惯的改变、晚婚晚育、卵巢功能不全发病率升高、肿瘤患者年轻化等因素，人类生育能力不断下降。尤其对于肿瘤患者来说，化疗、放疗仍是重要的辅助治疗方法，可以延长患者的生存期，同时也明显降低生育力，其中包括内分泌变化、性腺功能受损、卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI），甚至卵巢功能早衰［1］。研究发现，超过1/3的年轻女性肿瘤患者经过放化疗后会发生卵巢功能早衰，而且呈逐年上升趋势，因此在放化疗前对这些患者进行生育力保存成为解决这些患者生育问题的重要方法［2］。本文主要对生育力保存的适用人群、保存方法、保存方式等进行阐述，从而增强临床医师的生育力保存意识，并为进一步研究提供更多的思路。

1　生育力保存适用范围

1.1POI患者当成年女性闭经时间＞4个月，年龄＜40岁，血清卵泡刺激素（FSH）水平＞35 IU/L时称为POI。POI可导致女性不孕，大大降低生育能力。患者大多数为特发性，常见病因有基因异常、自身免疫异常、医源性因素（盆腔手术、放疗、化疗）、感染因素等［3］。Christin-Maitre等［4］研究发现POI发病率正逐年增加，目前发病率已高达1%～3%，严重影响了患者的生活质量。有研究表明，POI患者可通过将卵巢组织冷冻保存，然后适时解冻并体外激活（in vitro activation，IVA）使静止期的卵泡进入发育期，然后进行自体移植，从而获得生育力保存［3］。因此，如果年轻患者确诊为POI，且患者有生育要求，可以通过卵巢组织冷冻自体移植或卵子冷冻进行生育力保存［5］。

1.2肿瘤患者育龄期女性一经诊断患有肿瘤，大多数患者需进行放疗或化疗，但放化疗会造成患者生育能力下降，包括卵巢功能早衰、女性内分泌改变等，因此这类肿瘤患者是生育力保存的主要目标人群［2］。生育力保存的问题在进行放化疗前即应考虑。生育期的女性肿瘤患者，根据疾病治疗的迫切性、治疗方案、患者年龄、婚姻状况等不同情况，生育力保存方案应实现个体化。并且这个过程需要多个学科（包括妇产科、肿瘤科、生殖医学科）以及患者之间密切合作。一般认为，如果患者治疗前时间允许可以进行超促排卵、取卵，之后根据患者婚姻状况及意愿来选择卵子冷冻或胚胎冷冻。如果患者治疗时间不能推迟或者患有基础疾病不宜进行卵巢刺激，冷冻卵巢组织则成为首选方案。例如患淋巴瘤、白血病等血液病的育龄期女性，由于治疗需要立即进行，卵巢组织冷冻为最佳选择。对于乳腺癌患者，生育力保存的最佳时间是手术后到放化疗之前，因此可以进行胚胎冷冻或者卵母细胞的冷冻。但这2种冷冻方法需要控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS），而COS会使雌二醇水平升高可能影响患者病情发展，因此治疗前一定要多学科医师进行讨论以寻找最佳方案［6］。对于青春期前女性肿瘤患者，由于其尚未建立下丘脑-垂体-卵巢轴功能，如果想要保存生育能力，卵巢组织冷冻为最佳方案［7-8］。

1.3自身免疫性疾病严重的自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮、系统性硬化症、血管炎等，经过免疫抑制药物的治疗，尤其是环磷酰胺，在延长患者生存时间的同时，具有性腺毒性，可导致女性患者POI高发生率、不可逆转的闭经和不孕［9］。因此，自身免疫性疾病可在治疗前选择COS进行卵子冷冻或胚胎冷冻，亦可选择冷冻卵巢组织来进行生育力保存。

1.4欲将生育时间延后的人群许多女性因工作原因或自身因素等欲推迟生育时间，但是高龄孕育会产生许多问题。随着年龄增长，女性卵巢功能逐渐衰退，卵子质量亦逐渐下降，而且胚胎染色体异常发生率增加，进而增加了流产及孕育畸胎的风险。因此年轻时保存生育力成为这部分女性的选择。根据患者婚姻状况、法律法规、伦理原则等可选择卵子冷冻或胚胎冷冻。大多数人选择卵子冷冻，Ter Keurst等［10］认为冷冻卵母细胞的最佳年龄是36岁前。在我国禁止对未婚女性进行辅助生殖。

2　生育力保存方法

一般多采用低温冷冻保存的方法进行生育力保存，因此冷冻过程至关重要。若直接冻存细胞时，细胞内、外环境中的水分会形成冰晶，将导致细胞内发生一系列的变化，比如破坏细胞基质及细胞膜、破坏细胞结构、使电解质浓度升高、渗透压改变、pH值改变、蛋白质变性等，最终造成细胞的死亡［11］。冷冻时加入冷冻保护剂可减少对细胞的损伤。冷冻保护剂与溶液中的水分子结合，发生水化作用，弱水化的结晶过程使溶液的黏性增加，从而减少冰晶的形成。同时冷冻保护剂可渗透细胞内以维持细胞内外稳定的渗透压，降低细胞内外未结晶溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冷冻保护剂根据其是否能够穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇等。非渗透性冷冻保护剂一般是大分子物质，不能渗透到细胞内，该类保护剂主要包括蔗糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮等。两类保护剂同时使用冷冻效果更好。慢速程序化及玻璃化冷冻是目前常用的两种冷冻方法。

2.1慢速程序化冷冻多应用丙二醇和蔗糖作为冷冻保护剂，在缓慢降温的过程中让细胞逐步充分脱水，当细胞内水分被冷冻保护剂替代后，细胞内液的凝固点降低，在适当温度进行人工辅助植冰，然后在温度逐渐降至-35℃～-70℃时直接投入液氮（-196℃）中保存，人工辅助植冰是促使溶液结晶的方法，目的是为了诱导细胞内外冰晶逐渐形成，从而使细胞进一步脱水，防止过冷现象的发生。目前世界上公认最佳的植冰温度是-7℃［11］。

2.2玻璃化冷冻应用高浓度的冷冻保护剂溶液，如乙二醇、二甲基亚砜、蔗糖等使细胞快速脱水，然后大约以-15 000℃/min的速度急速降温至-196℃，使细胞内外的液体状态迅速转化为外形似玻璃的固体状态，因此称为玻璃化冷冻。由于玻璃化的液体在低温时黏稠度很高，保留了细胞内外液体正常的分子和离子分布，因而不产生冰晶，避免了冰晶造成的冷冻损伤。

研究发现，玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻相比具有一定的优势。玻璃化冷冻是一种快速的方法，不需要使用特殊的设备，节省时间和成本，尤其适用于整个卵巢组织的冷冻［12-13］。慢速冷冻步骤繁琐，耗时较长，所需设备昂贵，冷冻过程易产生细胞内冰晶［11］。有研究显示玻璃化冷冻的卵子形态学更加完整，细胞器的生理机能包括Ca2+信号传导更加完善［14］。玻璃化冷冻对卵母细胞发育能力的损害更小、对细胞基质的保护性更强，对MⅡ期卵母细胞的基因表达谱的影响更小［15］。同样在胚胎冷冻方面，玻璃化冷冻亦优于慢速程序化冷冻。对于卵裂期胚胎，玻璃化冷冻有更高的复苏率及更好的临床结局［16］。Zander-Fox等［17］认为玻璃化冷冻复苏后桑葚胚和早期囊胚的生存率、早期囊胚的发育情况均显著优于慢速程序化冷冻。对于卵巢组织冷冻，玻璃化冷冻对卵巢组织有更好的保护作用，卵巢间质形态的完整性更好，可作为替代慢速冷冻的较好选择［13，18］。Herraiz等［19］研究亦发现使用玻璃化冷冻不会影响卵巢组织正常形态、毛囊和血管的分布，优于慢速程序化冷冻。

3　生育力保存方式

3.1胚胎冷冻在体外受精-胚胎移植技术中，由于使用大量促排卵药物，会得到多枚卵子及胚胎，移植后剩余的胚胎即可进行冷冻保存，然后适时解冻并再次移植到女性子宫。胚胎冷冻技术成熟，无论是慢速程序化冷冻还是玻璃化冷冻，均能获得较为理想的复苏率和妊娠率。该技术可以有效减少患者超促排卵次数，目前已广泛应用于临床。胚胎冷冻适用于生育期已婚妇女，包括癌症患者放化疗前［20］。

3.2卵母细胞冷冻卵母细胞冷冻技术适用于以下情况：①体外受精过程中因各种原因导致取卵当日不能获得精子进行受精。②由于各种原因欲推迟生育年龄的女性。③有卵巢功能早衰风险的女性。④癌症患者放化疗前。Chen［11］于1986年报道首例卵子冷冻复苏成功病例，随后许多生殖中心开始陆续开展此项冷冻技术。但是由于卵母细胞结构的特殊性造成其冷冻技术比冷冻胚胎难度加大，因此卵母细胞复苏率和临床妊娠率都较低。随着玻璃化冷冻技术日趋成熟，卵母细胞冷冻技术亦逐步改善，使得该技术应用越来越广泛。卵母细胞冷冻在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞均有尝试，Lee等［21］研究发现先将GV期、MⅠ期卵母细胞体外培养至MⅡ期再进行冷冻效果更佳。因此，目前大多数胚胎学家倾向于冷冻成熟的卵母细胞。虽然玻璃化冷冻使卵母细胞冷冻技术日趋成熟，但是由于卵母细胞对温度异常敏感，特别是在冷冻、解冻过程中易导致减数分裂过程中的纺锤体去极化、染色单体分离异常而产生非整倍体，因此这一技术尚需进一步完善。

3.3卵巢组织冷冻卵巢组织冷冻和移植为需放化疗的肿瘤患者带来了生育力保存的福音，尤其是青春期前的年轻女性肿瘤患者，卵巢组织的冷冻成为她们生育力保存的唯一希望。卵巢组织冷冻使数以千计的卵母细胞保存起来，可以通过卵巢组织自体移植使卵巢功能得到恢复。由于卵巢组织冷冻要通过手术获得卵巢组织，因此该方法主要应用于患有肿瘤和自身免疫性疾病的患者。

卵巢组织冷冻主要冷冻保存卵巢的皮质组织，因为冷冻整个卵巢组织非常困难，主要是由于整个卵巢组织对冷冻剂的输注和扩散具有局限性［22］。目前的研究主要是卵巢皮质片段冷冻及移植，具有取材容易、体积小、冷冻保护剂易于渗透、可多次移植等特点。2004年，卵巢组织冷冻移植使癌症患者生出健康婴儿成为现实［23］。据报道，截止到2013年，卵巢组织冷冻的自体移植已成功应用于60例肿瘤患者［24］，到2015年，分娩超过40例婴儿［25］。

尽管卵巢组织冷冻保存了肿瘤患者的生育力，但生育力重建仍存在许多问题。主要问题在于卵巢组织冷冻的损伤及移植后在血管再生期间由于缺血造成的大量卵泡凋亡。此外，移植后卵巢的寿命、移植多少卵巢组织最为理想、癌症患者经过放化疗后自体移植是否发生肿瘤转移、冷冻方案的选择、冷冻期间是否存在组织间的污染等均是亟待解决的问题。

4　结语

总之，女性生育力保存已经被越来越多的人关注，胚胎冷冻技术比较成熟已应用于临床，但仍受到伦理、道德、宗教的限制。卵母细胞冷冻技术日趋成熟且为建立卵子库提供了可能性，对那些欲推迟生育年龄的女性是不错的选择，但是对未婚女性卵子冷冻尚有法律法规的限制及存在伦理上的争议。卵巢组织的冷冻是年轻女性肿瘤患者的首选，应用前景甚广，但是仍处于实验阶段。卵巢组织冷冻的损伤以及移植后卵泡凋亡、组织的缺血损伤等使卵巢组织的冷冻和移植面临巨大的困难。提高冷冻技术、减少复苏后卵泡凋亡数量、改善移植后组织血运状况等问题，需要研究人员在今后的基础研究和临床工作中逐步解决。随着研究的不断深入，相信有更多的女性会受益于生育力保存技术。

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Research Progress of Female Fertility Preservation

LI Wei，ZHANG Na.
Department of Reproductive Medicine，The Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China
Corresponding author:ZHANGNa，E-mail:13833116806@163.com

2016-06-23）

［本文编辑秦娟］

050011石家庄，河北医科大学第四医院生殖医学科

张娜，E-mail：13833116806@163.com

△审校者