维吾尔族与汉族帕金森病患者ATP13A2基因Thr12Met位点突变分析

李桂花，夏 欢，杨新玲

·论著·

维吾尔族与汉族帕金森病患者ATP13A2基因Thr12Met位点突变分析

李桂花，夏 欢，杨新玲

【摘要】目的探讨ATP13A2基因Thr12Met位点突变在新疆维吾尔族、汉族帕金森病(PD)患者中是否存在差异。方法选取2012年8月—2015年3月新疆伊犁地区、和田地区、乌鲁木齐市流行病学调查中及就诊于新疆医科大学第一附属医院的原发性PD患者420例为病例组(包括维吾尔族200例、汉族220例)，同时选取流行病学调查中及就诊于新疆医科大学第一附属医院的健康体检者400例为对照组(包括维吾尔族198例、汉族202例)。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)和基因测序方法对两组人群进行检测，分析ATP13A2基因Thr12Met位点突变情况。结果在420例PD患者和400例健康体检者中，仅出现2例汉族PD患者发生Thr12Met位点杂合变异AG基因型，且2例PD患者均是早发型帕金森病(EOPD)患者，未发现有纯合变异AA基因型，维吾尔族病例组和对照组均未发现纯合变异AA基因型和杂合变异AG基因型。ATP13A2基因Thr12Met多态性在所有病例组与对照组、维吾尔族病例组与对照组、汉族病例组与对照组、维吾尔族病例组与汉族病例组、EOPD组与晚发型帕金森病(LOPD)组、男病例组与女病例组基因型及等位基因分布间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论新疆维吾尔族与汉族ATP13A2基因Thr12Met位点突变率均极低，且Thr12Met位点基因型及等位基因分布间无明显差异；Thr12Met位点的基因型及等位基因与民族、发病年龄及性别均为无明显相关性。

【关键词】帕金森病；ATP13A2基因；Thr12Met位点；突变；维吾尔族；汉族

李桂花，夏欢，杨新玲.维吾尔族与汉族帕金森病患者ATP13A2基因Thr12Met位点突变分析[J].中国全科医学，2016，19(4)：437-441.[www.chinagp.net]

Li GH,Xia H,Yang XL. ATP13A2 gene Thr12Met site mutations of patients with Parkinson′s disease of Uygur and Han ethnic groups[J].Chinese General Practice，2016，19(4)：437-441.

ATP13A2 Gene Thr12Met Site Mutations of Patients With Parkinson′s Disease of Uygur and Han Ethnic GroupsLIGui-hua,XIAHuan,YANGXin-ling.DepartmentofGeneralMedicine,CancerHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the difference in ATP13A2 gene Thr12Met site mutations in patients with Parkinson′s disease (PD) between Uygur ethnic group and Han ethnic group. MethodsFrom August 2012 to March 2015,we enrolled 420 patients (including 200 Uygur people and 220 Han people) with primary PD who received treatment in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University or were the respondents of the epidemiological investigation in Yili Prefecture,Hotan Prefecture and Urumqi. We also enrolled 400 healthy people (including 198 Uygur people and 202 Han people) who received physical examination in the hospital and were the respondents of the epidemiological investigation in the same period as control group. PCR-RELP and gene sequencing method were employed on both groups. Analysis was made on ATP13A2 gene Thr12Met site mutations. ResultsAmong 420 PD patients and 400 healthy controls,the AG genotype with heterozygous mutation at Thr12Met site was found in 2 PD patients of Han ethnic group. The two patients both had early-onset Parkinson′s disease (EOPD),and no AA genotype with homozygous mutation was found in them. No AA genotype with homozygous mutation or AG genotype with heterozygous mutation was found among Uygur people in case group and healthy controls. In the comparison of genotype and allele distribution,there were no significant differences in Thr12Met polymorphism of ATP13A2 genes between case group and control group,between Uygur patients in case group and Uygur patients in control group,between Han patients in case group and Han patients in control group,between Uygur patients and Han patients in case group,between EOPD group and LOPD group and between male patients in case group and female patients in case group (P>0.05 for all). ConclusionUygur patients and Han patients have low mutation rate at ATP13A2 gene Thr12Met site and have no significant differences in genotype and allele distribution of ATP13A2 gene Thr12Met site. Genotype and allele distribution of Thr12Met site have no obvious correlation with ethnic groups,onset age and gender.

【Key words】Parkinson disease;ATP13A2 genes;Thr12Met site;Mutation;Uygur nationality;Han nationality

ATP13A2基因又名PARK9基因，是目前帕金森病(Parkinson′s disease，PD)基因遗传发病机制研究的热点之一[1]。报道显示ATP13A2基因是PD发病的易患致病基因，在早发型帕金森病(early-onset Parkinson′s disease,EOPD)和家族性PD患者中均可发现 ATP13A2 基因突变[2]。目前研究报道Thr12Met突变类型与EOPD及家族性PD相关[3]。国内外关于Thr12Met突变与EOPD 相关的报道为数不多。因此ATP13A2基因Thr12Met位点的突变与PD的相关性需要进一步深入研究，特别是此基因位点突变特点与不同种族EOPD的相关性及可能机制更需扩大样本研究。新疆地处中亚，世代居住于该地区的维吾尔族相比汉族具有遗传背景的差异性，而且国内尚罕见探索不同民族间PD易患性与ATP13A2基因Thr12Met位点多态性及突变相关联的报道，故本研究在课题组前期工作的基础上，探讨ATP13A2基因位点Thr12Met多态性和突变性与新疆地区维吾尔族和汉族人群散发型帕金森病(sporadic Parkinson′s disease,SPD)发病(尤其是EOPD)的关系以及与临床症状的相关性。

1对象与方法

1.1研究对象选取2012年8月—2015年3月新疆伊犁地区、和田地区、乌鲁木齐市流行病学调查中及就诊于新疆医科大学第一附属医院的原发性PD患者420例为病例组。纳入标准：(1)均符合英国帕金森病协会脑库(brain bank)临床诊断标准[4]；(2)均为SPD患者；(3)完成所有调查量表、实验室检查项目及临床基本资料完整；(4)长期生活在新疆地区(2代以上)；(5)未与其他民族通婚的维吾尔族及汉族。排除标准：(1)继发性帕金森综合征、帕金森叠加综合征、家族性帕金森综合征等患者；(2)伴有各种严重器质性疾病患者，如心功能不全、恶性肿瘤、血液病、肝肾疾病者。同时选取流行病学调查中及就诊于新疆医科大学第一附属医院的健康体检者400例为对照组。纳入标准：(1)与PD患者生活环境、饮食习惯和受教育程度相似，性别、民族相同，年龄相差不超过5岁；(2)无PD家族史。排除标准：不能确诊的疑似PD患者。

1.2研究方法获得患者知情同意后，抽取外周静脉血2 ml置于含800 μl乙二醇四乙酸的抗凝管中，使用天根生化(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，严格按照试剂盒配套说明操作书操作。检验DNA纯度为1.7～1.9，浓度≥10 ng/μl，判为DNA纯度合格。样本-20 ℃保存，备用。引物设计由上海生工公司合成，分别为(Thr12Met位点)上游：PF 5′-CAGGCTGATGTTTATTGTTTTTA-3′(f)，下游：PR 5′-CTCTCACCTCTTTGTCTCTTATT-3′(r)；聚合酶链反应(PCR)体系共20 μl： 2×Tap PCR Master Mix 10 μl,10 μmol/ml上下游引物各0.5 μl，100 ng/μl DNA 2 μl，去离子水补至20 μl。PCR反应条件(Thr12Met位点)：94 ℃预变性3 min，经过25个循环(94 ℃变性30 s,57.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸7 min，保存于4 ℃，PCR产物为491 bp；将7 μl PCR产物加样于2%琼脂糖凝胶中，以120 V电泳30 min，于紫外光凝胶成像仪下观察是否存在特异性目的片段，将符合特异性长度片段的目的片段采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)方法进行酶切，酶切反应体系总体积20 μl，包括PCR产物10 μl,10 ×缓冲液2 μl,限制性内切酶(10 U/μl)0.5 μl,加双蒸水至20 μl，将上述物质加入0.2 ml优质灭菌Elmendorf PCR管中，其后放入37 ℃恒温箱中过夜(需16～24 h)。然后取出进行酶切产物确认，取酶切产物进行聚丙烯凝胶电泳，用紫外线凝胶电泳成像分析系统判断酶切结果。

2结果

2.1受试者基本情况420例PD患者中，男245例，女175例；维吾尔族200例(男118例、女82例)，汉族220例(男127例、女93例)；≤50岁EOPD 101例(男54例、女47例，维吾尔族52例、汉族49例)，>50岁晚发型帕金森病(LOPD)319例(男191例、女128例，维吾尔族148例、汉族171例)。400例健康体检者中，男208例，女192例；维吾尔族198例(男102例、女96例)，汉族202例(男106例、女96例)；≤50岁110例(男60例、女50例，维吾尔族59例、汉族51例)，>50岁290例(男148例、女142例，维吾尔族139例、汉族151例)。

2.2TP13A2基因Thr12Met位点PCR、PCR-RELP及测序结果Thr12Met多态位点基因型分为野生GG基因型、纯合变异AA基因型和杂合变异AG基因型，在本研究中应用PCR-RELP方法，在420例PD患者和400例健康体检者中，仅有2例汉族PD患者发生杂合变异AG基因型，且2例PD患者均是EOPD患者；未发现有纯合变异AA基因型。维吾尔族PD患者和对照组未均未发现纯合变异AA基因型和杂合变异AG基因型。(1)ATP13A2基因Thr12Met位点经PCR 扩增后产物片断的理论值为491 bp，在2.0%琼脂糖凝胶上电泳可显示该PCR的扩增产物(见图1)。(2)Thr12Met位点在 NIaIII 酶切后，酶切产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，野生GG基因型显示330、161 bp两条带，杂合变异AG基因型(出现105、161、330 bp三条带)，未发现纯合变异AA基因型(见图2)。(3)将PCR-RELP酶切后可疑发生变异的基因样本进行测序验证，结果显示SNP位点反向测序，图中黑色箭头所指为碱基替换处(上图为GG基因型，下图为AG基因型)，从下图可以看出从左向右碱基序列第7个本来是G的，结果突变成了A，测序结果为杂合变异，双峰图(见图3)。

注：M为DNA标志物；1～7为PCR扩增产物电泳图；PCR=聚合酶链反应

图1 Thr12Met PCR扩增产物电泳图

Figure 1Electrophoresis of PCR product of Thr12Met

注：M为DNA标志物；1、4为AG基因型；2、3、5为GG基因型

图2NIaIII酶切电泳图

Figure 2Electrophoresis after NIaIII

注：上图为GG基因型；下图为AG基因型

图3Thr12Met位点测序图

Figure 3Sequence diagram of Thr12Met site

2.3病例组与对照组Thr12Met位点基因型与等位基因分布比较两组Thr12Met位点基因型及等位基因分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布比较〔n(%)〕

Table 1Comparison of Thr12Met genotype and allele distribution between case group and control group

组别例数基因型GG AA AG等位基因G A对照组400400(100.0)00800(100.0)0病例组420418(99.5)02(0.5)838(99.8)2(0.2)P值0.6750.567

2.4维吾尔族、汉族病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布比较维吾尔族病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布间差异无统计学意义(P>0.05)；汉族病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布间差异无统计学意义(P>0.05)；维吾尔族病例组与汉族病例组Thr12Met位点基因型及等位基因分布间差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表2维吾尔族、汉族病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布比较〔n(%)〕

Table 2Comparison of Thr12Met genotype and allele distribution between Uygur and Han patients and healthy controls

组别例数基因型GG AA AG等位基因G A维吾尔族 对照组198198(100.0)00396(100.0)0 病例组200200(100.0)a0a0a400(100.0)a0a P值0.6750.756汉族 对照组202202(100.0)00404(100.0)0 病例组220218(99.1)02(0.9)438(99.5)2(0.5) P值0.7650.564

注：与汉族病例组比较，aP>0.05

2.5不同发病年龄病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布比较≤50岁病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布间差异无统计学意义(P>0.05)；>50岁病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布间差异无统计学意义(P>0.05)；≤50岁病例组与>50岁病例组Thr12Met位点基因型及等位基因分布间差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

2.6不同性别病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布比较男病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布间差异无统计学意义(P>0.05)；女病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布间差异无统计学意义(P>0.05)；男病例组与女病例组Thr12Met位点基因型及等位基因分布间差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。

2.7Thr12Met位点不同基因表型(野生GG基因型与杂合变异AG基因型)PD患者临床资料分析在420例PD患者和400例健康体检者中，ATP13A2基因Thr12Met位点发生杂合变异AG基因型的仅有2例EOPD患者，这2例EOPD患者的僵硬、震颤等均较为严重，野生GG基因型PD患者共418例，由于变异样本量少，无法得出有统计学意义的结论(见表5)。

3讨论

目前已经报道了关于ATP13A2基因位点的不同杂合和纯合突变，如Gly504Arg、F182、Thr367Arg等纯合突变，以及一些杂合突变Thr12Met、Gly533Arg、Ala746Thr、Ala78Thr等[5]。其中研究报道认为Thr12Met位点突变类型与EOPD及家族性PD相关，Thr12Met杂合突变可能是 EOPD 疾病相关发病因素[6]。

ATP13A2基因位于1号染色体上，共编码29个外显子，Thr12Met位于1号染色体上2号外显子上，Thr12Met多态性位点为G→A转换，苏氨酸被甲硫氨酸代替(Thr→Met)。本研究应用PCR-RELP结合测序技术，通过对新疆地区维吾尔族 、汉族 PD患者及健康人群的基因多态性分析，结果提示ATP13A2基因Thr12Met多态以野生GG基因型多见，仅发现2例PD患者携带杂合突变AG基因型，未见纯合突变AA基因型。Crosiers等[7]在两个发病年龄分别为30、40岁的意大利SPD患者中各发现一个杂合突变Thr12Met和Gly533Arg，在一个来自巴西的发病年龄为12岁的散发帕金森综合征患者中发现了ATP13A2基因的1个GlyS04Arg纯合突变。在本研究中亦发现了Thr12Met杂合突变，与既往国外研究结果基本一致。

表3不同发病年龄病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布比较〔n(%)〕

Table 3Comparison of Thr12Met genotype and allele distribution between case group and control group in two different age ranges

年龄例数基因型GG AA AG 等位基因G A≤50岁 对照组110110(100.0) 0 0220(100.0)0 病例组10199(98.0)a0a2(2.0)a200(99.0)a2(1.0)a P值0.5430.654>50岁 对照组290290(100.0)00580(100.0)0 病例组319319(100.0)00638(100.0)0 P值0.6750.765

注：>50岁病例组比较，aP>0.05

表4不同性别病例组与对照组Thr12Met位点基因型及等位基因分布比较〔n(%)〕

Table 4Comparison of Thr12Met genotype and allele distribution between case group and control group of different genders

组别例数基因型GG AA AG 等位基因G A男 对照组208208(100.0)00416(100.0)0 病例组245244(99.6)a0a1(0.4)a489(99.8)a1(0.2)a P值0.7650.675女 对照组192192(100.0)00384(100.0)0 病例组175174(99.4)01(0.6)349(99.7)1(0.3)P值0.5640.786

注：与女病例组比较，aP>0.05

表5　Thr12Met多态位点不同基因表型PD患者临床资料分析

注：a为400例PD患者中共有293例服用过美多巴，AG基因型2例反应良好；GG基因型271例良好，20例欠佳；EOPD=早发型帕金森病，LOPD=晚发型帕金森病，UPDRS-I,II,III=帕金森病评分量，H-Y分级=Hoehn-Yahr分级

本研究中Thr12Met位点发生杂合变异AG基因型均见于EOPD患者中，在LOPD患者中未发现任何突变，本研究同时发现出现AG基因型变异的PD患者僵硬、震颤程度均较为严重，但由于变异样本量少，与野生GG基因型的PD患者无法做比较，故在今后研究中仍需继续扩大样本量，以期得出有统计学意义的相关性结论。Thr12Met位点突变在本研究SPD患者中发病率为0.48%，与既往研究报道基本一致[8]。但目前国内外仍缺乏大量关于Thr12Met位点突变的相关报道，Thr12Met位点突变与PD发病，尤其是与EOPD患者发病相关性仍需课题组今后扩大样本量进一步研究。

虽然新疆的维吾尔族具有欧洲人和蒙古人的血统，有着与汉族人种不同的遗传背景，但是通过比较ATP13A2基因Thr12Met位点的基因型和等位基因分布发现在新疆的维吾尔族与汉族两民族PD患者中差异不明显，维吾尔族病例组及汉族病例组分别与其相应民族的对照组多态位点基因型和等位基因频率分布比较差异亦不明显，提示该基因的多态位点在这两个民族PD患者间可能存在较小的差异性。男病例组及女病例组与相应性别的对照组基因型及等位基因频率分布比较差异不明显，表明ATP13A2基因Thr12Met多态性可能与性别无关。按年龄分组比较，本研究表明在≤50岁病例组及>50岁病例组与相应年龄的对照组间差异均不明显，与Mao等[3]的研究结果“好发于EOPD患者”有所不同。

总之，有明确遗传基因倾向的家族性PD仅占10%～15%，占绝大数量的SPD病因仍不明确，事实上，在过去的几十年里有多篇报道提出并争论具有SPD发病风险的基因位点，分析得出多数多态与散发性PD很少或没有明显相关性，提示该疾病可能需要更大规模，非偏倚的基因检测方法。部分报道结果无法重复，也可能导致假阳性或假阴性结果。因此，只有不断扩大试验样本量，重复检测结果，才能找出真正与PD发病相关的易感基因多态及突变位点。

作者贡献：李桂花主要进行试验的实施，资料收集及论文的撰写、成文并对文章负责；夏欢进行资料收集，试验实施；杨新玲进行试验设计，质量控制与审校、评估。

本文无利益冲突。

参考文献

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(本文编辑：崔沙沙)

(收稿日期：2015-09-12；修回日期：2015-12-28)

【中图分类号】R 741

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.04.016

通信作者：杨新玲，830000新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学附属肿瘤医院综合内科；E-mail：poplar862@sohu.com

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金资助面上项目(2014211C106) ——ATP13A2基因亚型Ala746Thr和Thr12Met突变类型与新疆维吾尔族早发型帕金森病的相关性研究
作者单位：830000新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学附属肿瘤医院综合内科(李桂花，夏欢，杨新玲)；新疆医科大学附属中医院脑病二科(李桂花)