支原体固体培养与液体培养在支原体感染诊断中的应用效果比较▲

黄秀荣 张群先 刘爱菊 陆 爽 梁慧娜 黄丽月

(广西河池市人民医院检验科，河池市 547000，E-mail：wangxiaoli5081@126.com)

临床创新

支原体固体培养与液体培养在支原体感染诊断中的应用效果比较▲

黄秀荣 张群先 刘爱菊 陆 爽 梁慧娜 黄丽月

(广西河池市人民医院检验科，河池市 547000，E-mail：wangxiaoli5081@126.com)

目的 比较固体培养及液体培养在支原体感染诊断中的应用效果。方法 采用固体培养基和液体培养基平行检测628例泌尿生殖道标本的支原体感染情况，比较两种方法的检出阳性率及污染率，对液体培养阳性而固体培养阴性、液体培养阴性而因体培养阳性的标本进行分析。结果 固体培养法的检出阳性率为45.86%(288/628)，液体培养法的为49.36%(310/628)。固体培养法的污染率为1.91%，低于液体培养法的8.44%(P<0.05)。液体培养阳性而固体培养阴性共42例，经液体培养传代后取其红色培养液转种到固体培养基上再次培养，有13例(2.07%)长出支原体典型菌落，且原固体培养经延长培养时间(延长24 h)后也出现少数支原体典型菌落。液体培养阴性而固体培养阳性共20例(3.18%)，取其液体培养的红色浑浊培养液转种到固体平板培养再次培养，可见有支原体生长。结论 液体培养污染率大、易误诊，但可快速检测药敏结果；固体培养污染率低，且能直接观察到支原体属特有的典型菌落，两者结合诊断对指导临床治疗具有较好的临床应用价值。

支原体感染；固体培养；液体培养

支原体是一种最小的原核细胞型微生物，能够在无生命的培养基上繁殖生长，其种类繁多、分布广泛，具有很强的传染性，主要感染泌尿生殖系统，严重影响人们的身心健康，甚至导致不育不孕等，降低人们的生活质量。支原体感染前期患者无症状或症状不明显，因此未能得到及时诊断、治疗。目前我国实验室检测支原体常用的方法是液体培养法，该方法方便、快捷、灵敏度高，但液体培养法只是通过添加不同底物进行生化反应而间接判断结果，存在假阳性，且存在较为严重的污染问题。固体培养法能够准确观察支原体的菌落形态，有一定的优越性。本研究采用固体培养基和液体培养基对628份泌尿生殖道标本进行平行检测，分析其检出阳性率、污染率等，为临床提供诊断参考依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源 2014年4～8月我院妇科、皮肤性病科、泌尿外科收集的泌尿生殖道标本628份，其中女性332例，年龄11～54岁，男性296例，年龄18～62岁。均采用无菌拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物，同一患者均取双份标本，采集后及时送检。

1.2 试剂与仪器 所用的液体培养基为解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum，Uu)和人型支原体(Mycoplasmahominis，Mh)分离、鉴定、药敏试剂盒(由郑州安图生物工程股份有限公司提供；批号：20140122)；固体培养基为Uu和Mh的选择性培养基(由江门市凯林贸易有限公司提供；批号：140311)。仪器选用普通的光学显微镜(BX43奥林巴斯)和上海比朗智能生化培养箱、常州冠军CHP-160二氧化碳培养箱。

1.3 培养方法 标本一般在收集后2 h内接种。固体培养基培养：将其中一份标本拭子直接滚动涂划在固体培养基上，编号后放入二氧化碳培养箱培养。液体培养基培养：将另一份拭子标本置入液体培养基内反复搅拌并在瓶壁内挤压，尽量把全部样本都洗于培养液中，丢弃棉拭子，然后取100 μl混合液置入检测板各孔中，滴加矿物油覆盖，然后将检测板条放入生化培养箱，35～37℃条件下孵育。

1.4 结果观察与判定 (1)固体培养：培养48 h后(若阴性则延长到60 h后观察)在低倍镜下观察固体琼脂平板上是否有支原体属特征性菌落生长。若见到典型棕褐色海胆样支原体菌落(菌落中有沙粒状物质，直径10～50 μm)为Uu阳性，若见到煎蛋样支原体菌落(直径100～300 μm)为Mh培养阳性，若同时见到上述两种菌落则为Uu、Mh混合阳性，若无典型菌落生长，则为阴性。(2)液体培养：培养48 h后观察结果。培养液由黄色变为红色且澄清者判定为阳性，无颜色变化或颜色变红但出现明显混浊或沉淀者判定为阴性。(3)污染判定：固体琼脂平板上有杂菌生长并影响结果观察则判为固体培养污染；液体培养液变红但出现明显浑浊或沉淀的则判为液体培养污染。

2 结 果

2.1 固、液体培养结果及检出阳性率的比较 628例泌尿生殖道标本，固体培养阳性288例(45.86%)，阴性340例(54.14%)，其中固体培养有12例杂菌生长严重影响结果观察而判定为阴性；液体培养阳性310例(49.36%)，阴性318例(50.64%)，53例培养液为红色浑浊而判定为阴性。

2.2 固、液体培养法污染率的比较 固体培养有12例杂菌生长严重影响结果判断，污染率为1.91%；液体培养有53例培养液红色浑浊，污染率为8.44%，液体培养污染率高于固体培养，差异有统计学意义(χ2=27.27，P<0.05)。

2.3 液体培养阳性而固体培养阴性、液体培养阴性而固体培养阳性的标本二次固体培养结果 固、液体培养同时为阳性268例，同时为阴性298例。液体培养阳性而固体培养阴性共42例。将42例经液体培养传代后取其红色培养液转种到固体培养基上再次培养，有13例(2.07%)长出支原体典型菌落，且原固体培养经延长培养时间(延长24 h)后也出现少数支原体典型菌落；其余29例，经液体培养传代后取其红色培养液二次固体培养和延长原固体培养时间(延长24 h)均无支原体菌落生长。

液体培养阴性而固体培养阳性共20例，均为液体培养后的培养液为红色浑浊而判定为阴性，而在原固体培养可见到支原体典型菌落。这20例(3.18%)取其液体培养的红色浑浊培养液转种到固体平板再次培养，可见有支原体生长。其余液体培养时培养液为红色浑浊而判定为阴性的33例，原固体培养无支原体生长，取其红色浑浊培养液转种到固体平板培养也无支原体生长。

3 讨 论

本研究对628例泌尿生殖道标本分别采用液体培养、固体培养法检测支原体，结果显示液体培养检出率为49.36%(310/628)，固体培养法检出率为45.86%(288/628)，与陈红霞等[1]报告相似。目前我国使用的支原体液体培养试剂是商品化试剂盒，操作十分简便，是利用培养与生化反应相结合的原理进行支原体培养、鉴定、计数和药敏测定。Uu具有脲酶，能分解尿素产生氨或胺，Mh具有精氨酸脱羧酶分解精氨酸也产生氨气，均可使培养液的pH升高，指示剂变红色，加上支原体个体微小，生长繁殖后也不会使培养液出现浑浊或生成沉淀，因此以培养48 h内液体变红且澄清者判定为阳性。但这种生化反应特异性较差，不是支原体所特有，极少量碱性标本也可会直接导致培养液变红，从而出现假阳性；此外尽管培养液有多种抗生素可抑制杂菌生长，但由于临床上抗生素滥用，有可能导致检测标本中含有少数有分解尿素或精氨酸能力的耐药菌株，从而引起假阳性反应。本研究中，有29例初次液体培养阳性而固体培养阴性，但经液体培养传代后二次固体培养和延长原固体培养时间均无支原体菌落生长，如根据首次液体培养结果进行诊断，可导致误诊。同时，液体培养阴性而固体培养阳性共20例(3.18%)，而取其液体培养的红色浑浊培养液转种到固体平板再次培养均可见有支原体生长，这一比例低于周良佳[2]报告的结果，可能和标本类型、所用试剂厂家不同有关。液体培养时可因培养液变红色并出现浑浊可导致假阴性，而培养液变红色且浑浊的原因有：(1)细菌或真菌污染标本引起浑浊，同时伴有支原体生长；(2)标本的上皮细胞、白细胞或黏液过多引起浑浊，同时有支原体生长[3]；(3)无支原体生长，具有分解尿素或精氨酸能力的细菌、真菌污染引起。由此可见，仅凭颜色变化和是否浑浊来判定液体培养的结果会导致假阳性和假阴性，也无法判断那些红色浑浊标本是否有支原体生长，从而造成漏检[4]。因此，在对浑浊培养液进行判断时，应该加用固体培养基进行确认。

含有支原体生长营养成分的固体培养基，抑菌能力较强[5]，特异性好，与液体培养相比其有很大优势：(1)首先培养24～48 h后固体培养基上长出低倍镜下可以观察的典型的支原体菌落，不会出现假阳性，结果可靠；(2)其次在固体琼脂平板上可以同时鉴别不同的支原体，有利于支原体的分类和纯化。在本次实验中，我们发现在培养24 h后固体培养基上就可见到Uu和Mh菌落，48 h后菌落形态更加典型，Uu呈典型海胆样菌落(10 ～50 μm)或不典型微小型、空泡型支原体样菌落[6]，Mh呈油煎蛋样菌落(100～300 μm)；再者固体培养基上少有其他杂菌生长，即使有少量生长也不影响支原体的生长和观察[7]。本研究中，有37例在固体培养基上有杂菌生长，但其中25例杂菌菌落少，不影响支原体生长和观察，只有12例长满杂菌影响结果观察而判为阴性，污染率为1.91%，与潘新娣等[8]报告相似，且污染率明显低于液体培养(P<0.05)。本研究结果显示，液体培养阳性而固体培养阴性的42例标本中，有13例经液体培养传代后固体培养长出支原体典型菌落，而原固体培养经延长培养时间(约24 h)也出现少数支原体典型菌落。其原因可能是原标本含支原体量太少，直接接种到固体琼脂平板上的菌落极少，在显微镜下不易发现，或是固体琼脂平板放置过久，琼脂水分蒸发，支原体难于生长。因此，当液体培养出现阳性而固体培养阴性时最好延长固体培养时间，以免漏检。

综上所述，液体培养仅靠颜色、清浊度来判读结果，主观性强，无法确认支原体是否存在，临床实验中由于标本易污染常出现误诊或漏诊，但该方法操作简便、快捷，又附带药敏结果，可作为支原体检测的初筛试验；固体培养可直接观察到支原体特有典型菌落而确证支原体的存在，其污染率小，不易漏诊，可作为支原体检测的确认试验；两种方法联合使用具有快速、准确的检测效果，且具有培养与药敏同时进行的特点，可提高支原体感染诊断的准确性，从而提高治疗疗效，特别是针对症状明显、疗效不佳、反复发作的患者。

[1] 陈红霞,陶日新,杨振强,等.液体培养法检测泌尿生殖道支原体属的效果评价[J].中华医院感染学杂志,2011,21(23):5 092-5 094.

[2] 周良佳,连大帅,许 锴,等.现有液体培养法检测解脲脲原体效果的评价[J].中国人兽共患病学报,2015,31(1):16-20.

[3] 陈佑明,劳小斌,刘京平.泌尿生殖道支原体液体显色培养法与固体培养法的比较[J].热带医学杂志,2008,8(1):45-46,42.

[4] 邢建明,李 刚,张雅琴,等.两种不同培养方法检测解脲、人型支原体结果平行性分析[J].中国卫生检验杂志,2010,20(6):1 442-1 443.

[5] 杨晓华,谭 南,林爱心.泌尿生殖道支原体液体培养法检测的实验评价[J].检验医学与临床,2010,7(6):531-532.

[6] 周运恒,马红霞,曹广亚,等.两种培养方法检测解脲脲原体及其菌落形态学的比较研究[J].检验医学,2013,28(5):362-365.

[7] 李 婷,叶元康.固体培养基直接分离解脲脲原体和人型支原体方法的研究[J].中华检验医学杂志,2005,28(10):1 081.

[8] 潘新娣,施前锋,邵伟芳.支原体属固体与液体培养相结合在临床感染诊断中的应用[J].中华医院感染学杂志,2013,23(4):949-951.

广西河池市科学研究与技术开发计划(河科推1430-4)

黄秀荣(1972～)，女，硕士研究生，副主任技师，研究方向：微生物检验。

R 518.9

A

0253-4304(2016)10-1455-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.34

2016-04-20

2016-07-01)