自噬在维持肠道内稳态中的作用

吴振婷 秦少游 贾二娜 葛安琪 周长玉



·综述·

自噬在维持肠道内稳态中的作用

吴振婷 秦少游 贾二娜 葛安琪 周长玉

肠道内稳态依赖于肠道菌群、肠上皮细胞及肠黏膜免疫细胞间复杂的相互作用，不同类型肠细胞通过多种途径调节肠道微生态、限制致病菌、调控肠道局部炎性反应。自噬参与组织细胞的免疫应答及免疫防御。目前有文献报道，自噬对维持肠道内稳态也起着重要的作用。学者们通过建立自噬缺陷细胞模型发现，自噬异常可影响不同类型肠细胞的功能，进而导致肠道内稳态失衡和慢性肠道炎性疾病发生，该文就此作一综述。

自噬；肠道内稳态；细胞生物学

自噬是真核细胞通过溶酶体途径降解错误折叠和长寿命的蛋白质、受损的细胞器、胞内微生物等物质的过程。在正常生理状态下，组织细胞内的自噬水平很低，而在饥饿和低氧、内质网应激等外界因素作用下诱导启动的自噬作用可为细胞提供营养及能量，继而促进细胞存活，故目前认为自噬对维持细胞和组织内稳态发挥着一定的作用[1-3]。近年来有文献报道，自噬异常可导致肠道内稳态失衡和慢性肠道炎性疾病的发生，本文就自噬在维持肠道内稳态中的作用作一综述。

1 自噬的概述

自噬是不同于凋亡的另一种程序性死亡[4]，为进化高度保守的细胞内降解途径，所有的真核生物体内均存在自噬过程。根据靶分子运输到溶酶体方式的不同，自噬分为小自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬(CMA)[5]。巨自噬是双层膜结构的自噬体形成的过程，较为普遍，相关研究也较多，与慢性炎性反应的调节的关系较为密切，本文所指的自噬均为巨自噬。在自噬现象中，基础自噬能在生理条件下通过降解细胞内错误折叠的蛋白质或受损、老化的细胞器并重新利用以维持细胞内稳态；选择性自噬是在饥饿或外界压力的诱导下降解细胞内特定结构以保护细胞。入侵到细胞内的病原体的降解过程则称为异体自噬。

自噬过程依赖于自噬相关基因(Atg)编码的蛋白质，首个自噬相关基因Atg1在酵母中被发现，迄今为止共发现了30余种自噬相关基因[6-7]。自噬相关基因对于自噬体的形成、促进细胞存活至关重要，因其在酵母、蠕虫、果蝇及哺乳动物间呈高度保守性，故在酵母中获得的自噬相关研究结果同样可应用于哺乳动物细胞。

2 自噬与肠道内稳态

肠道内稳态依赖于肠道菌群、肠上皮细胞及肠黏膜免疫细胞间复杂的相互作用，不同的调控机制协同作用共同维持肠道内稳态。本文聚焦于不同类型的细胞在调节肠道生态、限制致病菌、控制炎性反应中的作用，了解自噬异常如何影响肠道内稳态。

2.1 肠上皮细胞

2.1.1 潘氏细胞 潘氏细胞(PC)是小肠腺特征性细胞，位于小肠隐窝底部，细胞顶部胞质充满粗大的嗜酸性分泌颗粒，可分泌抗菌肽、防御素(人源性防御素5、6)等多种抗菌物质以抑制肠道致病微生物的繁殖，从而维持肠道内稳态[8-10]。关于自噬对PC功能影响的相关研究主要集中在Atg16L1和克罗恩病(CD)相关风险等位基因Atg16L1 T300A。Lassen等[11]将Atg16L1 T300A基因敲入6～8周C57BL/6小鼠胚胎干细胞中，结果发现表达Atg16L1 T300A小鼠与野生型小鼠相比，前者PC分泌颗粒数量减少、分布杂乱和溶菌酶弥散性染色。Cadwell等[12]的研究发现，Atg16L1等位基因变异(T300A)纯合子的CD患者均出现PC异常，包括PC形态异常、颗粒分泌减少及分布杂乱和溶菌酶弥散性染色等改变，因此推测Atg16L1基因突变是CD患者自噬缺陷的主要原因。Cadwell等[13]的动物实验观察到，分别缺乏Atg16L1、Atg5、Atg7基因的Villin-Cre鼠末端回肠部位PC在颗粒胞外分泌途径均出现显著异常，且出现与携带Atg16L1 T300A基因纯合子的CD患者类似的PC改变。除Atg16L1和Atg16L1 T300A异常可致PC改变外，有学者在Atg4B缺陷鼠体内也发现了PC异常，如Cabrera等[14]将纯合子Atg4B缺陷的8～12周C57BL/6、129Sv小鼠饲养在无菌环境中，并给其饲喂葡聚糖硫酸钠(DSS)7 d，成功获得结肠炎模型后，通过透射电子显微镜观察其回肠部位，发现PC的分泌颗粒与野生型鼠相比，数量减少，体积减小，并且由电子致密核心和低电子密度的外围光环组成。上述研究提示自噬异常可能通过影响PC的分泌途径，或影响其胞内分泌颗粒和溶菌酶数量、形态及分布，导致其抗菌能力减弱，进而使肠道内稳态失衡。

2.1.2 杯状细胞 杯状细胞是肠道内的另一种分泌细胞，主要功能是通过分泌黏蛋白覆盖肠腔表面，形成黏液层，构成肠上皮细胞抵御细菌入侵的第一道防线[15]，其中黏蛋白2是黏液层的主要成分；除此之外，杯状细胞还分泌Fc-γ结合蛋白(作为偶联剂稳固黏蛋白结构)、三叶因子(促进受损黏膜修复)、抗微生物肽(AMP)等，上述多种物质共同维持肠道内稳态。Patel等[16]应用阿尔新兰染色敲除Atg5基因Villin-Cre鼠肠道杯状细胞并免疫标记黏蛋白2，结果发现Atg5缺陷小鼠杯状细胞内黏蛋白数量较对照组明显增加；采用同样方法观察Atg7或LC3β缺陷鼠，亦可发现杯状细胞内黏蛋白的累积现象，其累积原因考虑与黏蛋白颗粒胞外分泌途径受阻有关。Lassen等[11]应用PSA/阿尔新兰分别染色表达Atg16L1 T300A的C57BL/6小鼠小肠杯状细胞，提示细胞形态改变、体积增大。关于自噬参与杯状细胞分泌过程的说法已被认可，但是具体的生物学机制尚不十分清楚。目前研究推测存在自噬缺陷的杯状细胞可能通过阻碍黏蛋白分泌，使肠道黏液层防御屏障薄弱，增加微生物与肠上皮细胞间的相互作用，从而导致肠道内稳态的失衡，诱导慢性炎性反应形成或对正常细胞产生过度免疫应答。

2.1.3 吸收细胞 吸收细胞是组成肠上皮细胞的主要细胞，位于基底部，呈高柱状，故又名柱状细胞，电子显微镜下细胞游离面由密集而规则排列的微绒毛构成。其主要功能是建立防止细菌易位的屏障，并从摄取的食物中吸收营养。在这些细胞中，自噬作为细胞固有先天免疫的一部分，发挥限制细菌繁殖和传染的作用，该功能缺陷诱发肠道内稳态失衡。Conway等[17]应用鼠伤寒沙门菌(血清型)感染Atg16L1缺陷的Villin-cre鼠，48 h后获得鼠的盲肠和小肠组织，与正常对照组相比，Atg16L1缺陷鼠的肠组织炎性反应程度较重，促炎因子白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β分泌水平明显升高，且自噬清除沙门菌属的功能减弱，对其他组织的传染性增强。Benjamin等[18]给敲除Atg5基因的C57BL/6小鼠饲喂鼠伤寒沙门菌24 h后，观察到Atg5缺陷小鼠自噬体形成减少，细胞质内感染菌数量增多，且在小鼠的脾脏、肝脏均发现鼠伤寒沙门菌。除鼠伤寒沙门菌外，对其他革兰阴性菌的研究，包括黏附侵袭性大肠杆菌(AIEC)，也证明了自噬在维持肠道内稳态中的重要作用。如Lapaquette等[19]敲除鼠胚胎成纤维细胞的Atg5基因，并使其感染AIEC，观察6 h后发现Agt5缺陷鼠细胞内AIEC数量较对照组明显增多。上述研究推测，吸收细胞自噬缺陷可能使肠道限制细菌繁殖及易位的功能受损，进而导致肠道炎性反应发生，引起肠道内稳态失衡。除自噬缺陷外，吸收细胞的自噬增强对肠道内稳态的维持也有一定的影响。吸收细胞不仅具有抗菌功能，还具有重要的营养吸收功能，细胞表面的微绒毛结构可以增加表面积，增强肠细胞的吸收功能，然而自噬增强可导致微绒毛缩短，进而减弱细胞的吸收功能，但具体作用机制尚不十分清楚[20]。

2.2 抗原递呈细胞

2.2.1 巨噬细胞 肠道是巨噬细胞最大的聚集场所，其主要功能是免疫监视和细菌清除，其本质是通过分泌前列腺素E2和IL-10清除入侵的微生物和破损的细胞碎片，促进上皮细胞更新并调节T细胞增殖[21-22]。自噬在肠道巨噬细胞清除真菌、细菌、寄生虫中起着重要的作用。如A20蛋白为核因子-κB(NF-κB)抑制剂，降解A20蛋白可以增强巨噬细胞中NF-κB活性，进而促进抗真菌免疫。Kanayama等[23]向骨髓细胞中缺乏Atg7的C57BL/6小鼠静脉注射1×106或2×105白色念珠菌分生孢子，结果发现Atg7缺陷小鼠24～48 h存活率及体质量均明显降低，3 d后观察小鼠体内各器官表面真菌负载量也明显增加，且细胞内A20蛋白也较前增多，说明自噬缺陷可使小鼠抗真菌能力减弱。而Li等[24]向Atg7缺陷C57BL/6J小鼠饲喂1×107CFU铜绿假单胞菌，TUNEL试验结果发现Atg7缺陷小鼠的巨噬细胞活力减弱且细胞凋亡增加；Kaplan-Meier生存曲线显示Atg7缺陷小鼠的1周存活率较野生型小鼠明显降低。此外，干扰素-γ(IFN-γ)或IFN-γ+脂多糖(LPS)可通过诱导活化巨噬细胞，促使细胞内纳虫空泡膜裂解，从而清除入侵的微生物。Zhao等[25]敲除鼠巨噬细胞中的Atg5基因，并使该鼠感染弓形虫，5 h后给予IFN-γ或IFN-γ+LPS治疗，电子显微镜下可见Atg5缺陷鼠感染的弓形虫所存在的纳虫空泡膜完整，而对照组的则被裂解；并发现Atg5缺陷鼠对弓形虫的易感性较对照组增强，生存率、体质量均明显降低。说明Atg5在IFN-γ或IFN-γ+LPS诱导破坏弓形虫空泡膜、限制弓形虫繁殖及清除寄生虫中发挥了重要的作用。目前研究推测自噬可能通过影响巨噬细胞监视和清除细菌过程来维持肠道内稳态。

2.2.2 树突状细胞 树突状细胞(DC)位于淋巴组织、免疫器官中，也存在于机体与外界环境的接口处，如肠黏膜。DC是适应性免疫系统不可缺少的一部分，其主要功能是通过主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ和MHCⅡ处理和递呈抗原到淋巴细胞。DC通过在体内迁移而发挥强大的抗原递呈功能，尤其是DC归巢至引流淋巴结是激发T细胞免疫应答的关键步骤之一。因此，DC可通过对微生物启动适当的免疫反应来维持肠道内稳态。Lee等[26]敲除C57BL/6小鼠DC中的Atg5基因，并使该鼠阴道感染1×106PFU单纯疱疹病毒(HSV)，7 d后观察发现DC不能归巢至髂淋巴结，且效应CD4+T细胞及其分泌的IFN-γ数量较野生型小鼠明显减少，说明Th1细胞免疫应答减弱，DC在通过MHCⅡ处理和递呈抗原时表现出免疫功能缺陷。Liu等[27]利用弓形虫感染Atg5缺陷的6～8周C57BL/6小鼠，也发现其效应CD4+T细胞分泌IL-2和IFN-γ数量明显减少，表现出与感染HSV时相同的变化。自噬缺陷可使机体免疫系统清除病毒、细菌、寄生虫障碍，但在自噬增强时同样可以诱发自身免疫性疾病。Hubbard-Lucey等[28]使Atg16L1缺陷的6～9周C57BL/6雌鼠接受同种异体造血干细胞移植，7 d后与野生型小鼠相比，体内DC表达升高，T细胞增殖增强，进而移植物抗宿主反应增强，小鼠发病率、死亡率均上升。Cooney等[29]的研究也指出，携带NOD2或Atg16L1风险变异基因的CD患者的DC在自噬诱导和MHCⅡ抗原递呈细菌抗原中存在缺陷。目前研究推测自噬异常可能通过阻碍DC递呈微生物抗原到达肠淋巴细胞，使T细胞激活受损且分泌炎性因子减少，从而导致肠道内稳态失衡。

2.3 淋巴细胞

2.3.1 T细胞 效应T细胞对于维持肠道免疫环境的稳定具有重要的意义。目前已认识到CD是一种典型的Th1型反应，而溃疡性结肠炎(UC)则是一种非典型的Th2型反应。多项自噬缺陷的动物模型研究表明，自噬在T细胞发育、极化和记忆及维持T细胞稳态与存活中起着重要的作用[28,30-34]。Stephenson等[33]条件性敲除C57BL/6小鼠Atg5或Atg7基因，观察发现淋巴结、脾脏、胸腺和外周血的CD4+和CD8+T细胞数量较对照组均显著减少，并且细胞生存周期显著缩短。而Xu等[34]同样敲除C57BL/6小鼠Atg5或Atg7基因，发现其外周血T细胞数量和T细胞受体(TCR)刺激活化后T细胞增殖能力下降。Th1型CD4+T细胞和细胞毒性CD8+T细胞是特异性细胞免疫的主要效应细胞，自噬缺陷可使这两种细胞分化减少，进而在免疫清除时出现免疫功能异常。此外，缺乏Atg5或Atg7的小鼠T细胞在病毒攻击后向记忆CD8+T细胞分化减少[31-34]，进而在下一次抗原入侵时其增殖、分化产生效应T细胞数量减少，导致病原体清除能力减弱。目前研究推测自噬能通过诱导特异性抗炎/促炎效应T细胞的数量或调节效应T细胞的功能和记忆来影响肠道环境的炎性反应状态，从而调节肠道内稳态。

2.3.2 B细胞 分泌lgA抗体的浆细胞构成肠上皮B细胞的主要组成部分。炎症性肠病(IBD)患者的肠组织中lgA分泌减少，推测lgA水平与肠道内稳态的维持有关。因lgA可阻断病原体黏附、覆盖在病原体表面促进清除、直接抑制病原体毒力和控制肠道微生物，故其是肠道第一道防御线的关键组成部分[35]。Pengo等[36]条件性敲除鼠B细胞中的Atg5基因，观察发现Atg5缺陷鼠较野生型鼠的体液应答减弱，免疫球蛋白lgM分泌减少，说明Atg5在维持细胞稳态和体液免疫中起着重要的作用。而Conway等[37]也通过酶联免疫斑点试验(ELISpot)发现，B细胞缺乏Atg5基因的小鼠肠组织中lgA分泌较野生型鼠明显减少，在特异性抗原刺激下产生抗体应答、寄生虫感染和黏膜炎性反应中反应减弱。目前研究推测自噬可能通过调节体液免疫来维持肠道内稳态。

3 展望

肠道内稳态的维持需要多系统协同作用，自噬异常可通过改变不同类型细胞的功能来使肠道内稳态失衡，导致肠道炎性疾病的发生。建立恰当的实验模型来了解自噬异常导致疾病发生发展的机制是非常必要的，它有助于研发特异性介导自噬药物，为临床提供新的治疗方法。

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(本文编辑：林磊)

130000 长春，吉林大学中日联谊医院消化内科

周长玉，Email: doczcy@163.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.05.004

2016-05-18)