超高效液相色谱-串联四级杆质谱法测定中药材（饮片）中非法添加6种水溶性红色素通用方法的研究＊

徐昱婷，张学博，苏 静，龚 瑞，徐 刚，沙禕炜＊＊

（1. 闸北区卫生和计划生育委员会 上海 200070；2.上海市崇明食品药品检验所 上海 202150；3. 上海食品药品包装材料测试所 上海 201203）

超高效液相色谱-串联四级杆质谱法测定中药材（饮片）中非法添加6种水溶性红色素通用方法的研究＊

徐昱婷1，张学博2，苏 静2，龚 瑞3，徐 刚2，沙禕炜2＊＊

（1. 闸北区卫生和计划生育委员会 上海 200070；2.上海市崇明食品药品检验所 上海 202150；3. 上海食品药品包装材料测试所 上海 201203）

目的：建立快速筛查及确证中药材（饮片）中非法添加6种水溶性红色素（日落黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红、新品红、酸性红73）的超高效液相色谱-串联四级杆质谱的通用方法。方法：中药材（饮片）经溶剂提取后，采用超高效液相色谱法分离，以乙腈和5 mmol·L-1乙酸铵溶液为流动相，进行梯度洗脱，采用多反应监测模式，筛查中药材（饮片）中非法添加的6种水溶性红色素，并进行确证。结果：超高效液相色谱-串联四级杆质谱可在4 min内快速筛选并确证是否含有非法添加的6种水溶性红色素。结论：该方法具有简便快捷、灵敏度高、结果准确的特点，适用于中药材（饮片）中非法添加6种水溶性红色素的筛查和确证工作。

超高效液相色谱-串联质谱 色素 中药材（饮片） 非法添加

近年来，在药品检验工作中发现有不法分子将假、劣药材染色后冒充正品，颜料染色伪制的常用药材、贵细中药材（饮片），外观性状酷似正品，隐蔽性大，不易辨别。如果缺乏相关的药材知识和严格的监管制度，这些假冒伪劣中药材会在临床应用，这将扰乱药材市场，严重影响中药材的临床合理、安全、有效用药，甚至危及患者的生命。若染色药材经进一步加热炮制，如蒲黄炒炭、黄芩酒炒等，其中的化工染料又可能因受热分解产生新的有害物质。这会给患者用药安全带来潜在威胁，给患者家庭造成重大经济损失。因此，必须随时随地予以严厉打击，依法检查和处理假冒伪劣中药材[1，2]。

目前，中国中药材（饮片）现行标准中，对于此类染色现象的相关标准较少，国内外对于中药材（饮片）中非法添加色素检测方法的相关研究报道文献较少，而检测多组分色素或色素系列的方法更为罕见。在检测中药材（饮片）非法添加色素的研究工作中，检测方法开始向仪器化和自动化发展，目前色素测定多采用薄层色谱法[3，4]、液相色谱法[5-9]和气相色谱-质谱法[10]，而液相色谱-质谱法[11-14]则主要用于食品检测，且食品中色素检测方法[15]较为多样和通用。虽然，《中国药典》2015年版第四部有9303色素测定法指导原则[16]，但覆盖面和通用性尚需完善。

由于不法分子贪图利益，中药尤其是中药材（饮片）非法添加色素的状况愈演愈烈。因此，建立系统的中药材（饮片）多组分色素的检测方法工作迫在眉睫。

为解决以上问题，本研究采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱法测定法，建立了一种快速筛查和确证中药材（饮片）中非法添加6种水溶性红色素的通用方法。

1 实验部分

1.1 仪器、药品与试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统（美国Waters公司）；Waters BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；TQD三重四级杆质谱仪（美国Waters公司）；0.2 μm针式滤器（上海安谱公司）。

乙腈、甲醇（德国Merck公司，色谱纯）；纯净水（中国娃哈哈公司）；其余试剂均为分析纯；日落黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红、酸性红73、新品红标准品（购自中国药品生物制品检定所）；朱砂、紫苏梗、乌梅、五味子、枸杞子、鸡血藤、丁香、红花、玫瑰花、丹参（均为市售商品药材）。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流速：0.2 mL·min-1， 柱温：25℃， 进样量：10 μL，样品室温度：20 ℃，流动相：采用5 mmol·L-1乙酸铵溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱表

1.3 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源（ESI），正离子模式（ESI+）；扫描方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；毛细管电压：3.5 kV，去溶剂气温度400℃，离子源温度：120℃，用于定性的离子对及锥孔电压和碰撞能量参数[17]见表2。

表2 六种色素质谱MRM多反应监测其他条件

1.4 标准储备液和工作液的配制

精密称取适量的各色素标准品，用70%乙醇溶解并定容至10 mL，配制出1 mg·mL-1标准储备液，于-20℃下保存。精密量取各色素标准储备液200 μL，用水定容至100 mL，作为混合标准工作液，于4℃下保存。

1.5 样品前处理

1.5.1 阳性样品制备

取已知不含任何色素的丁香和鸡血藤，将标准混合溶液按0.4 mg·g-1比例，定量喷洒加入中药材（饮片）中，挥干溶剂，置烘箱中50℃干燥4 h，作为阳性样品。

图1 6种色素一级质谱图及结构式

1.5.2 供试品溶液制备

称取中药材（饮片）或阳性样品2 g，加70%乙醇20 mL，超声提取20 min，取上清液离心，精密量取1 mL，用水定容至20 mL，过0.20 μm聚醚砜微孔滤膜后，作为供试品溶液。

2 结果

分别取朱砂、紫苏梗、乌梅、五味子、枸杞子、鸡血藤、丁香、红花、玫瑰花、丹参等药材共计13批样品，其中红花3批，按上述实验条件进行测定。由实验结果表明，朱砂、紫苏梗、乌梅、五味子、鸡血藤、丁香、玫瑰花、丹参及一批红花中均未检出含有色素，有两批红花中含有日落黄和胭脂红（《中国药典》2015年版未收载的色素[16]）。

该方法将超高效液相色谱的高速、高分离度与串联四级杆质谱的高选择性、高灵敏度相结合，具有通用性强、选择性好、灵敏度高、便捷省时的优点。本研究建立了中药材（饮片）中日落黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红、酸性红73、新品红的UPLC-ESI-MS/MS检测的方法，方法快速、简单、灵敏，抗干扰能力强，定性准确，一次提取和进样即可完成多成分色素的筛查，也适用于中药材（饮片）中这6种红色素的确证，其检测结果也为中药材（饮片）监督检查提供确切、有效的科学法律依据，可用于中药材（饮片）日常监督检测工作。

3 讨论

3.1 样品处理方法的优化

3.1.1 提取方法

日落黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红、酸性红73、新品红均为水溶性色素，极性较大，各色素均在水、70%乙醇中有较好的溶解性，为了获得较高的提取效率，通过实验比较，选择70%乙醇作为提取溶剂。为了减少操作步骤及提高提取效率，采用超声提取方式对样品进行提取。考察了不同提取时间和和提取次数的提取效果，最终确定最佳的样品处理条件。

3.1.2 过滤器的选择

由于中药材（饮片）成分较复杂，经70%乙醇提取后，可能存在一些杂质。本实验选择亚微米粒径的色谱柱，这些杂质的存在容易堵塞液相色谱柱，也有可能污染质谱。为了净化样品，避免损失仪器，样品需通过0.20 μm微孔滤膜进行净化。实验室常用样品过滤器有尼龙66（Nylon）、聚醚砜（PES）、聚偏氟乙醚（PVDF）、混合纤维素（MCE）等。本实验考查了各种针式滤器对样品的吸附作用。实验结果表明，尼龙66、混合纤维素等常用针式滤器对样品明显的吸附作用。因此本实验采用聚醚砜（PES）针式滤器对样品进行净化。

3.2 色谱条件的优化

3.2.1 色谱柱的选择

本实验采用1.7 μm粒径色谱柱与传统5 μm粒径的色谱柱相比，分析时间大大减小，柱效大大提高，同时显著提高了样品分析的通量。

3.2.2 流动相的选择

通过实验分别考察了有机相溶剂（甲醇和乙腈）与不同种类挥发性缓冲液组成的流动相体系，如甲醇（或乙腈）-5mmol·L-1甲酸铵溶液、甲醇（或乙腈）-5mmol·L-1乙酸铵溶液、甲醇（或乙腈）-0.1%甲酸溶液等、结果表明，以乙腈 -5mmol·L-1乙酸铵溶液作为流动相时色谱峰形、分离效果和质谱信号相应最佳。通过比较不同乙酸铵缓冲液离子强度的影响，分别考察了浓度2 -10 mmol·L-1乙酸铵溶液，结果表明5mmol·L-1乙酸铵为最佳添加量。通过梯度洗脱方式，各色素能得到有效分离。

图3 空白溶剂总离子流图

3.3 质谱条件的优化

本实验所检测的色素为偶氮类、蒽醌类和三芳基甲烷类色素。在ESI+和ESI-离子化模式下，对各色素进行全扫描，选择适当的电离方式和子离子。结果表明，日落黄、新品红、苋菜红、胭脂红、酸性红73、赤藓红在ESI+电离模式下均具有较高的丰度。苋菜红、胭脂红、日落黄、赤藓红为含钠色素，母离子为[(M-nNa)+(n+1)H]+，新品红为含氯色素，母离子为[M-Cl+H]+。在确定各色素准分子离子后，对二级质谱进行分析，对子离子进行优化选择，确定定量离子和定性离子。通过优化毛细管电压、一级锥孔电压、二级锥孔电压、萃取锥孔电压、碰撞能量、质谱分辨率等质谱参数，使每种色素的特征碎片离子的强度达到最大。

由于苋菜红和胭脂红为同分异构体，母离子均为539，均有子离子223，因此在苋菜红和胭脂红在232子离子处有响应，但是苋菜红和胭脂红出峰时间不同，可明显区分苋菜红和胭脂红，出峰顺序依次为苋菜红、胭脂红。

3.4 UPLC-ESI-MS/MS优点

本实验方法为发挥UPLC的最大优势，同时选用亚微米小颗粒填料色谱柱，提高了样品分离度、样品通量和灵敏度。0.2 mL·min-1的流速更适合质谱电喷雾化的要求，减少溶剂对结果的影响，所用溶剂也大大减少，减少了检验成本，与此同时，实验产生废液也大大降低。

图4 丁香阳性样品总离子流图

3.5 方法专属性

在本实验条件下分别称取朱砂（矿物类）、紫苏梗（全草类）、乌梅（果实类）、五味子（果实类）、枸杞子（果实类）、鸡血藤（藤茎类）、丁香（花类）、红花（花类）、玫瑰花（花类）、丹参（根茎类）药材按“1.5.2 供试品溶液制备”项下方法制备供试品溶液进行测定，结果表明，这5类10种中药材在相应色素色谱峰位置均不干扰色素的测定。实验还考察了溶剂对实验结果的影响，由实验结果表明，溶剂水和70%乙醇对色素测定均不干扰。

图5 鸡血藤阳性样品总离子流图

1 吴云燕,孙雪妮.中药饮片染色现象不容忽视.中草药,2001,32(8): 752-753.

2 饶伟文,蒋玲,赵纯玉,等.几种染色掺假中药的化工染料鉴定.药物分析杂志,2007,27(11): 1742-1745.

3 胡青,孙健.张甦,等. 中药中48 种非法染色色素的TLC法检测.中国医药工业杂志,2015,46(7): 695-700.

4 刘艳,张勤,吕志刚,等. 红花中非法添加色素的薄层色谱快速鉴别法.中国实验方剂学杂志,2014,20(18): 95-98.

5 李启艳,朱日然,孙萍,等. HPLC-DAD 法检测染红中药材中20种非法添加色素.医药导报,2015,34(5): 655-657.

6 郑娟,邹耀华. HPLC-PDA 法检测蒲黄和黄连中十种非法添加色素.中国卫生检验杂志,2011,21(5): 1078-1082.

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8 汪建君,陈惠玲. HPLC-PDA 法检测正天丸和正天胶囊中6 种非法添加色素.药物评价研究,2013,36(1): 51-53.

9 金竹昳,陈旭,戴小峰,等.利用HPLC 建立对比筛选法测定红花中色素金橙Ⅱ.天然产物研究与开发,2013,36(3): 384-387,402.

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11 吕东明,丁云连,詹晟,等. 超高效液相色谱/ 四极杆-飞行时间质谱法检测22 种禁用和限用合成色素.现代仪器与医疗,2013,19(2): 52-56.

12 侯建波,谢文,李杰,等. 液相色谱－串联质谱法测定虾肉中7种非食用色素的残留量.理化检验-化学分册,2015,51(11): 1541-1546.

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General Approaches to Determining Six Water-Soluble Red Pigments Illegally Added in Crude Drug (Prepare Slices) by UPLC-ESI-MS / MS

Xu Yuting1,Zhang Xuebo2,Su Jing2,Gong Rui3,Xu Gang2,Sha Yiwei2
(1. Shanghai Zhabei District Health and Family Planning Commission,Shanghai 200070,China; 2. Shanghai Chongming Institute for Food and Drug Control,Shanghai 202150,China; 3. Shanghai Food and Drug Packaging Material Control Center,Shanghai 201203,China)

The study aimed to establish a general method for the rapid screening and confirmation of the six water-soluble red pigments,sunset yellow,amaranth,carmine,erythrosine,new fuchsin and acid red 73,using UPLC-ESI-MS/MS. The six water-soluble red pigments were illegally added into crude drug or prepare slices. After extracting the samples through bysolvent extraction,the UPLC-ESI-MS / MS method was adopted using a gradient elution with the mobile phase of acetonitrile and ammonium acetate solution (5 mmoL·L-1). The MRM mode was performed to screen and quantitatively confirm the six red pigments added illegally. The results showed that UPLC-ESI-MS / MS method rapidly screened and confirmed whether the illegal six red pigments had been added into the crude drug or prepare slices within 4 minutes. In conclusion,the UPLC-ESI-MS / MS method was accurate and suitable for screening and confirming water-soluble red pigments in crude drug or prepare slices featuring simple,sensitivity and accuracy.

UPLC-ESI-MS/MS,pigment,crude drug (prepare slices), illegally additives

10.11842/wst.2016.05.031

R2

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2015-12-08

修回日期：2015-12-25

＊ 上海市食品药品监督管理局科技攻关课题（2011JY2-06）；中药材（饮片）中非法添加红色类色素的快速检测法及确证方法的建立，负责人：沙禕炜，苏静。

＊＊ 通讯作者：沙禕炜，在职研究生，主管中药师，主要研究方向：中药、食品（含保健食品）和化妆品检验分析及质量管理工作。