硫化氢通过抑制自噬减轻心脏停搏后脑损伤*

魏红艳，　李恒杰，　李　芳，　胡春林，　李　欣，　李　慧，　赵子然，　张　杰，　廖晓星

(中山大学附属第一医院急诊科，广东 广州 510080)



硫化氢通过抑制自噬减轻心脏停搏后脑损伤*

魏红艳，李恒杰，李芳，胡春林，李欣，李慧，赵子然，张杰，廖晓星△

(中山大学附属第一医院急诊科，广东 广州 510080)

[摘要]目的： 观察硫化氢在心肺复苏后脑保护中的作用，并探讨其对神经元细胞自噬的影响。方法: 窒息法建立大鼠心脏停搏模型。72只雄性Wistar大鼠随机分为假手术(sham)组、模型(model)组和硫氢化钠(NaHS)组。自主循环恢复(ROSC)后2 h、4 h、12 h和24 h用Western blot方法检测神经元自噬标志物beclin-1的表达和微管相关蛋白1轻链3(LC3)的转换；ROSC后12 h，用免疫组化方法观察LC3颗粒的表达；透射电镜观察神经元自噬现象；ROSC后72 h，TUNEL染色计数顶叶皮层凋亡神经元。ROSC后24 h、48 h和72 h行神经功能缺损评分(NDS)评价神经功能。结果: ROSC后2 h、4 h、12 h和24 h，model组自噬标志物beclin- 1的表达持续增加，而NaHS组beclin-1的表达先增加，然后逐渐降低(P<0.05)。自噬标志物LC3 II/I的表达也是同样趋势。免疫组化显示，ROSC后12 h，model组神经元胞浆和胞核LC3颗粒的比例较NaHS组明显增多(P<0.05)。电镜显示，model组自噬泡明显多于NaHS组及sham组(P<0.05)。TUNEL染色显示，ROSC后72 h凋亡神经元数量model组明显多于NaHS组及sham组(P<0.05)。NDS评分显示，NaHS组在各时点神经功能优于model组(P<0.05)。结论: 硫化氢可以抑制心脏停搏模型大鼠ROSC后神经元自噬，减少神经元凋亡，改善神经功能。

[关键词]硫化氢； 心脏停搏； 心肺复苏； 自噬； 神经元

尽管心脏停搏(cardiac arrest, CA)患者的自主循环恢复(restoration of spontaneous circulation, ROSC)率可高达40%～60%，但其最终出院存活率不足10%[1]，心脏停搏所导致的最严重后果是脑细胞的死亡。以往认为坏死和凋亡是细胞死亡的主要方式。近年来，一种新的程序性细胞死亡方式——自噬(autophagy)，即II型程序性细胞死亡，越来越受到重视。它不同于坏死与凋亡，适度的自噬是细胞完成自身代谢和细胞器更新的重要方式，对维持机体内环境稳定、调控细胞损伤和老化具有重要意义；而非生理性的、过度的自噬则会导致细胞过多死亡，从而引起组织器官产生病理性变化[2]。有关自噬现象在心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation, CPR)后脑损伤中的作用报道较少，有研究表明硫化氢(hydrogen sulfide， H2S)可以通过抑制自噬减轻心肌缺血再灌注损伤，本研究欲通过建立Wistar大鼠窒息模型，观察硫化氢在心肺复苏后脑保护中的作用，并探讨其对神经元自噬的影响。

材料和方法

1动物模型及实验分组

1.1动物模型本实验在中山大学卫生部辅助循环重点实验室进行。72只健康成年雄性Wistar大鼠，15～16月龄，体质量280～360 g，由中山大学实验动物中心提供。动物购进后在SPF级动物房饲养 1 周，实验前晚禁食不禁水。动物用戊巴比妥钠(Sigma)30 mg/kg腹腔注射麻醉：酌情给予1/4的首剂量维持。麻醉成功后，固定于操作台上。胸、背部皮肤备皮。用16 G鞘管经口气管插管，常规II导联心电监护，留置针(Becton Dickinson)穿刺右股动静脉，动脉管接高敏感换能器监测动脉血压。4通道生理信号采集分析系统(BIOPAC Systems)连续记录心率、血压信息。手术中用电热毯保持动物体温(35.0±0.5) ℃，持续监测肛温。手术完成后，待大鼠生理参数稳定开始诱导窒息，经股静脉推注维库溴铵2 mg/kg，观察大鼠呼吸、心跳停止时间，心跳停止以动脉收缩压<20 mmHg作为标准。持续心脏骤停5 min后开始CPR。先给予2 min的心前区胸外按压，按压频率200 min-1，按压深度为前后胸径的1/3，同时给予肾上腺素20 μg·kg-1·min-1，所有的胸外按压均由同一实验人员实施，接小动物呼吸机，通气频率75 min-1，潮气量15 mL/kg。反复进行上述CPR周期，如15 min未出现ROSC，宣布复苏失败。 ROSC的标准为恢复室上性心率，平均动脉压>60 mmHg持续10 min以上。

1.2实验分组实验动物随机分为假手术(sham) 组、模型(model)组和硫氢化钠(NaHs)组，各24只大鼠。假手术组仅行手术操作，不进行窒息和心肺复苏；模型组窒息后常规进行心肺复苏；NaHS组窒息后进行心肺复苏时立即给予硫氢化钠(10 mmol/kg)静脉注射。

2实验方法

2.1Western blot方法检测自噬标志物beclin-1和LC3的表达ROSC后分别于2 h、4 h、12 h和24 h随机处死3只大鼠，迅速取大脑皮层液氮冷却后储存于-80 ℃冰箱。处理脑组织冻存标本，按照全蛋白提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)说明，提取全蛋白，BCA法蛋白定量(北京百泰克生物技术有限公司)。取50 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，按湿转法将电泳产物转移到PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭2 h，滴加 I 抗(1∶1 000)4 ℃过夜，TBST洗膜，10 min，共3次，滴加HRP标记的 II 抗(1∶10 000)室温下孵育1 h，TBST洗膜，10 min，共3次，Millipore发光液浸泡1 min，Koda胶片曝光，显影、定影，计算蛋白灰度。 Beclin-1抗体购自CST； LC3抗体购自 Abgent；β-actin抗体购自Santa Cruz。

2.2免疫组化检测LC3颗粒ROSC后12 h每组随机处死3只动物取大脑皮层，制作石蜡切片，进行免疫组化观察LC3颗粒，具体步骤如下：常规石蜡切片脱蜡至水，3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，高温柠檬酸盐缓冲液抗原修复，LC3抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜，反复PBS清洗，加入标志 II 抗IgG(1∶300)，湿孵1 h。PBS冲洗，10 min，共3次。显色剂显色10 min，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片，镜检。

2.3TUNEL检测神经元凋亡TUNEL凋亡试剂盒购自Roche。具体步骤如下：(1) 取ROSC后72 h海马组织石蜡切片，常规脱蜡、梯度乙醇水化，PBS洗3 次；(2) 用抗原修复液行抗原修复；(3) 拭干切片周围水份，用Proteinase K 工作液(20 mg/L)孵育37 ℃ 30 min，PBS洗3 次；(4) 拭干切片周围水份，滴加免疫染色封闭液室温封闭60 min，PBS洗3 次；(5) 拭干切片周围水份，滴加50 μL TUNEL反应液于样本区域，于37 ℃、湿盒中避光反应60 min； PBS 漂洗3 次；(6) DAPI染核3 min，免疫荧光封片剂封片；(7) 在IX71型倒置荧光显微镜(Olympus)下观察，计数凋亡细胞，计算凋亡率。

2.4电镜观察自噬泡的形成ROSC后12 h处死动物，迅速取脑，用眼科剪取顶叶皮层区2.0 mm× 0.5 mm×0.5 mm小块组织，1%锇酸4 ℃冰箱中固定1 h～2 h。将标本进行漂洗、固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色后于电镜下观察并拍片，每张切片不同部位各选取10个神经元，每个神经元随机选取3个视野，在高倍镜视野下观察并计数每个神经元胞浆内自噬泡数量。

2.5神经功能缺损评分(neurologic deficit score, NDS)分别于ROSC后24 h、48 h和72 h进行NDS评分。NDS评分内容包括意识状态、呼吸、颅神经功能、运动感觉功能和行为5个部分，范围为0～500，其中0～100为正常、500为死亡。ROSC后24 h、48 h和72 h分别由3个不同的医生进行评分，3人的平均分为最终评分。

3统计学处理

所有数据录入SPSS 13.0统计软件进行分析，依据正态检验结果分别用均数±标准差(mean±SD)或四分位数法表示，依据正态检验结果用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组均数间差异的两两比较用SNK法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1基本参数

48只大鼠均成功诱发窒息致心脏停搏， 窒息前各组动物的基本生理学参数——体重(body weight, BW)、心率(heart rate, HR)、呼吸频率(respiratory rate, RR)、收缩压(systolic blood pressure, SBP)、舒张压(diastolic blood pressure, DBP)和平均动脉压(mean arterial pressure MBP)，以及复苏相关参数——基础生命支持时间(basic life support, BLS)和肾上腺素(epinephrine)用量见表1。Model组20只ROSC成功，NaHS组22只ROSC成功，ROSC率两组之间差异无统计学显著性，但72 h存活率比较，Model组与NaHS组分别为6/12和9/12(P<0.05)。

表1各组动物的基本生理学参数和复苏相关指标

Table 1.The physiologic and CPR parameters in three groups(Mean±SD.n=24)

ParameterShamModelNaHSROSC__20/2422/2472hsurvivalrate__6/129/12*BW(g)319±14323±16317±12HR(bpm)402±21405±24398±29RR(bpm)85±483±387±4SBP(mmHg)103±12108±10110±16DBP(mmHg)75±1080±1178±12MAP(mmHg)88±1287±1090±12BLS(min)1.0±1.21.0±1.61.0±1.4Epinephrine(μg)12±511±610±5

*P<0.05vsmodel.

2自噬标志物beclin-1和LC3蛋白的表达

Western blot结果表明，ROSC后，model组自噬标志物beclin-1的表达逐渐上升，而NaHS组先逐渐上升，然后逐渐恢复。其中，model组ROSC后2 h、4 h、12 h和24 h beclin-1的表达均明显高于sham组(P<0.05)。而NaHS组在ROSC后2 h、4 h、12 h和24 h beclin-l的表达明显下降，与model组相比，差异有统计学显著性。自噬标志物LC3 II/I的表达也是同样趋势，见图1。

Figure 1.The expression of beclin-1 and LC3 II/I. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vssham.

图1ROSC各组自噬标志物beclin-1及LC3 II/I的表达

3LC3颗粒的表达

免疫组化结果显示，ROSC后12 h，sham 组、model组与NaHS组神经元胞浆LC3颗粒和细胞核的比例分别为0.12±0.02、0.36±0.05、0.25±0.03，两两比较差异均有统计学意义，见图2。

Figure 2.The formation of LC3 dots at 12 h after ROSC. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmodel;#P<0.05vssham.

图2ROSC后12 h LC3颗粒的表达

4神经元自噬泡的形成

透射电镜显示，ROSC后12 h, model组自噬小体数量明显多于NaHS组及sham组(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The numbers of autophagic vacuole in the 3 groups at 12 h after ROSC (×16 500). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmodel;#P<0.05vssham.

图3ROSC后12 h每组自噬小体的形成情况

5神经元凋亡情况

TUNEL染色显示，ROSC后72 h，sham 组、model组和NaHS组凋亡神经元比例分别为3%、25%和15%，各组间差异有统计学显著性(P<0.05)，见图4。

6NDS神经功能评分

NDS评分显示，model组在ROSC 24 h、48 h和72 h NDS评分的中位数分别为300、265和250，NaHS组在ROSC 24 h、48 h和72 h NDS评分的中位数分别为175、110和84，NaHS组神经功能优于model组(P<0.05)，见表2。

讨论

尽管亚低温、增强型体外反搏、乌司他丁等各种方法在心脏停搏后脑保护作用被指南推荐[3-6]，但在临床上应用效果仍不理想。近年来 H2S被认为是继一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后发现的第3种具有生物活性的内源性气体信号分子。H2S可以通过减少神经细胞凋亡而起到脑保护作用，在缺血再灌注损伤中的作用受到关注[7-10]，但具体机制不详，H2S是否可通过减少神经元自噬进而减少凋亡而发挥脑保护作用呢？

自噬是营养底物缺乏时细胞的适应性反应，自噬在机体的免疫、感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性病、缺血再灌注损伤的发病中具有十分重要的作用。在缺血/再灌注等各种因素刺激下，细胞启动自噬来提高细胞对缺血缺氧的耐受力，对细胞起到一定保护作用。研究表明自噬在缺血缺氧性脑损伤模型中被激活，对细胞的命运具有双向作用。由轻度或中度脑缺血或缺氧引起的生理水平的自噬具有保护作用(通过分解代谢产生能量阻止细胞坏死，通过清除受损的线粒体抑制细胞凋亡)；由严重脑缺血或缺氧引起的高水平的自噬可导致细胞死亡。种种迹象表明，再灌注后脑组织神经细胞自噬异常增多可能是导致脑损伤的重要启动因素之一[11]，如果能够早期、有效抑制自噬的发生，有望减轻脑损伤。

本研究中，两组之间ROSC成功率的差异无统计学显著性，但是72 h存活率有明显差异，molde组50%，NaHS组75%，NaHS组存活率明显升高，这与文献[12]报道的存活率基本一致，因本研究中采用窒息引起的心脏停搏，时间为5 min，但加上心脏停搏前窒息的时间，总缺氧时间为8 min，因此大鼠的总体死亡率较高。 Minamishima 等[12]报道经历8 min 心脏停搏并在CPR前1 min 时给予H2S供体硫氢化钠治疗的小鼠24 h 生存率明显提高，硫氢化钠能阻止CA/CPR所致的氧化应激和神经功能障碍恶化，而CPR后10 min延迟给予硫氢化钠治疗组预后较差，因此本研究采用开始心肺复苏即刻给予硫氢化钠，能够明显改善预后。

心脏停搏全脑缺血缺氧后，细胞内ATP水平迅速降低，导致腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)活性增加，进而激活自噬。本研究中探讨了H2S对神经元自噬的影响，model组自噬蛋白beclin- 1的表达逐渐上升，而NaHS组先逐渐上升，然后逐渐恢复；与model组相比较，NaHS组在ROSC后4 h、12 h和24 h beclin-1 的表达明显下降。LC3是一种自噬标志物，自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-II)，LC3 II/I比值的大小可估计自噬水平的高低，本研究中，NaHS组LC3II/I比值明显低于model组，且NaHS组神经元凋亡亦明显减少，说明H2S可以抑制ROSC后神经元过度自噬，减少凋亡，起到脑保护作用。与Wang等[11]研究结果一致，在严重脑缺血后自噬过度、持续激活，抑制过度的自噬水平可以减少海马CAl区神经元坏死。我们既往研究表明，H2S在体内6 h 左右达到高峰[13-14]，本研究也显示4 h后发挥了抑制自噬作用。既往报道H2S可以减轻缺血再灌注心肌损伤[15]、肝脏损伤[16]等，但较少有对全脑缺血缺氧的研究，本研究为心脏骤停后综合征的治疗提供新的思路及理论根据。

Figure 4.The neuron apoptosis in each group at 72 h after ROSC. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmodel;#P<0.05vssham.

图4ROSC后72 h 神经元凋亡的情况

表2ROSC后各组动物的NDS评分

Table 2.NDS after ROSC in the 2 groups [Median(Q1,Q3).n=24]

Group24h18h72hModel300(265,391)265(180,350)250(170,350)NaHS175(123,294)*110(75,238)*84(55,181)*

*P<0.05vsmodel.

综上所述，硫化氢可以抑制心脏停搏模型大鼠ROSC后神经元自噬，减少神经元凋亡，改善神经功能。但H2S抑制神经元自噬的具体机制尚需进一步研究。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Neuroprotective effect of H2S by inhibiting autophagy after restoration of spontaneous circulation in rats with cardiac arrestWEI Hong-yan, LI Heng-jie, LI Fang, HU Chun-lin, LI Xin, LI Hui, ZHAO Zi-ran, ZHANG Jie, LIAO Xiao-xing

(DepartmentofEmergencyMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:liaowens@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the neuroprotective effect of hydrogen sulfide (H2S) after cardiopulmonary resuscitation in rats with cardiac arrest (CA), and to explore the effects of H2S on neuron autophagy. METHODS: The CA model was established through asphyxia. Male Wistar rats were randomly divided into sham group, model group and NaHS group. The levels of beclin-1 and LC3 II/I were measured by Western blot at 2 h, 4 h, 12 h and 24 h after the restoration of spontaneous circulation (ROSC). At 12 h after ROSC, the formation of autophagic vacuole with LC3 dots was determined by immunohistochemical (IHC) method. The phenomenon of neuron autophagy was observed under transmission electron microscope. The numbers of apoptotic neurons were counted by TUNEL staining at 72 h after ROSC. The neurolo-gic deficit score (NDS) was used to evaluate the neurologic function after ROSC. RESULTS: The level of beclin-1 was gradually increased in model group, but it was increased and then gradually recovered in NaHS group (P<0.05). The conversion of LC3 II in the cerebral cortex was the same as beclin-1. The results of IHC showed that LC3-positive nuclei in model group were more than those in NaHS group (P<0.05). The number of autophagic vacuole in model group was more than that in NaHS group (P<0.05). The number of the TUNEL-positive cells in model group was more than that in NaHS group (P<0.05). The NDS of the animals in NaHS group after ROSC was lower than that in model group(P<0.05). CONCLUSION: H2S inhibits neuronal autophagy, decreases apoptosis and improves neurologic function in CA rats after ROSC.

[KEY WORDS]Hydrogen sulfide; Cardiac arrest; Cardiopulmonary resuscitation; Autophagy; Neurons

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.016

[中图分类号]R541.7； R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 020-87755766； E-mail: liaowens@163.com

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No.81372023 )；广东省医学科学基金资助项目(No.B2012085)

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 12- 03

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0284- 06