脾气虚证模型大鼠中BNP介导的cAMP-PKA信号通路对bFGF表达的影响*

姜晓琳，　张立德

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032 )



脾气虚证模型大鼠中BNP介导的cAMP-PKA信号通路对bFGF表达的影响*

姜晓琳，张立德△

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032 )

[摘要]目的： 以脾气虚证大鼠为研究对象，探讨脾气虚证导致的心功能变化及其机制。方法: 大鼠随机分为2组，分别为空白对照组及脾气虚模型组。采用小动物超声测定2组大鼠的心功能变化；HE染色观察心肌组织病理学变化；Western blotting法测定心肌中脑钠肽(BNP)的蛋白表达情况；ELISA法测定血清及心肌中BNP和cAMP含量；real-time PCR测定碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和蛋白激酶A(PKA)的mRNA表达。结果: 与空白组比较，脾气虚模型组大鼠心肌细胞发生不同程度坏死及变性，每搏输出量及射血分数均降低，血清及心肌中BNP和cAMP含量均升高，BNP蛋白表达及bFGF、PKA mRNA表达增加。结论: 脾气虚可引起大鼠心功能下降，机体BNP、cAMP含量及PKA、bFGF表达均有所增加。

[关键词]脾气虚证； 心功能； 脑钠肽； 碱性成纤维细胞生长因子

脾气虚证为中医临床主要证型之一，可因饮食不节、劳倦过度、外感淫邪及久病体虚等多种因素引起，导致患者出现不思饮食、神疲乏力及便溏等临床症状。中医学归纳脾的功能不仅涵盖了西医学的整个消化系统，而且与神经、内分泌、血液、循环、免疫、生殖、运动等系统生理功能密切相关[1]。中医理论认为，心为脾之母，脾虚日久，子病及母；加之，脾为气血生化之源，脾虚，生血乏源，血脉不充，可致心血亏虚。由此可见，脾气虚证可直接或间接引起行血异常，导致心系疾病的发生。借助现代科学技术和方法对脾气虚证的研究涉及消化吸收、免疫、微循环等系统的功能,结果显示脾气虚证的发病为先有运化不足，导致生化乏源，气血亏虚，此为脾气虚证的演变过程及与心脏病及老年气虚证等其它病证的转变关系[2]。但是脾气虚证导致心功能改变及其机制研究甚少，本研究以脾气虚证大鼠为研究对象，探讨脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)介导的心肌细胞cAMP-PKA信号转导通路的变化。

材料和方法

1实验动物、主要试剂和仪器

雄性SD大鼠，体重(200±10)g，由本溪实验动物中心提供，许可证号SCXK(辽)-2010-0001。

PMSF(博士德);RIPA组织细胞裂解液(Solarbio)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司；化学发光底物(Thermo)； I 抗稀释液(Beyotime)；I 抗(北京博奥森生物技术有限公司)；II抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为150112)；大鼠BNP ELISA试剂盒和大鼠环磷酸腺苷(cAMP)ELISA试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)；real-time PCR试剂盒(TaKaRa)。

Vevo2100型高分辨率小动物专用超声影像系统(VisualSonics)；iMark型酶标仪(Bio-Rad)；7500 real- time PCR仪(Applied Biosystems)；BioSpec-nano型紫外可见分光光度计(岛津)；BX51显微镜(Olympus)；RM2245型石蜡切片机(Leica)；冷冻离心机(Thermo)；Trans-Blot SD半干转印、垂直板电泳装置(Bio-Rad)；FA2004精密天平(上海佑科仪器仪表有限公司)。

2方法

2.1分组及造模动物购回后适应性喂养1周。取SD大鼠30只，随机分为2组，每组15只，分别为空白对照组和脾气虚模型组。参考《中药新药临床研究指导原则》[3]和《中医实验动物模型方法学》[4]，脾气虚组造模方法采用饮食不节加力竭游泳法，即先饱食1 d，再禁食2 d，自由饮水，每日于35～37 ℃水温下游泳至力竭，3 d为1个循环，连续5个循环。以大鼠出现食少、神疲乏力、消瘦、毛色枯槁无光泽及便软或溏等表现时为脾气虚证模型建立成功。

2.2心功能检查采用高分辨率小动物专用超声影像系统，为大鼠做彩色超声多普勒心动图，测定各组大鼠的左室收缩末期容积(end-systolic volume，ESV)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室舒张末期容积(end-diastolic volume，EDV)和左室每搏输出量(stroke volume，SV)，各项数值均经计算机处理后获得。

2.3心肌组织病理学检查实验结束后，各组大鼠禁食24 h，用20%氨基甲酸乙酯溶液将大鼠麻醉，处死后取心脏，用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，做常规苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察切片，观察空白组及模型组大鼠心肌组织病理学变化，并采集图像。

2.4心肌中BNP的表达采用Western blot法检测心肌中的BNP蛋白表达。取大鼠心肌组织100 mg放入玻璃匀浆器中，加入1 mL裂解液(蛋白裂解液与PMSF比列为100∶1)，在冰上充分研磨后，吸入到预冷的无菌EP管中，4 ℃下12 000 r/min离心10 min。取上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性后，每孔上样20 μL，电泳后转膜3 h，I 抗孵育1 h后，4 ℃ 过夜，次日II 抗孵育1 h后，暗室中加入ECL发光液后，曝光30 min，扫描图像后分析结果，得到目的蛋白与内参照GAPDH条带的吸光度比值后，再进行组间比较。

2.5血清及心肌中BNP和cAMP含量于实验结束后，各组大鼠禁食24 h，给予腹腔注射20%氨基甲酸乙酯溶液，剂量按照0.5 mL/100 g给药，待其完全麻醉后，腹主动脉取血，离心取血清。取心肌组织，制作组织匀浆液。ELISA测定各组大鼠血清及心肌中BNP和cAMP的含量，按照试剂盒说明书进行操作。

2.6bFGF和PKA的mRNA表达应用real-time PCR方法检测细胞bFGF和PKA的mRNA 表达。将留取的心肌组织匀浆，提取RNA，并对RNA进行清洗。于清洗后，应用分光光度法检测RNA浓度和纯度，经逆转录得到 cDNA 后扩增目的基因。以GAPDH为内参照，其上游引物为5’-TGGGTTTCCCGTTGATGA-3’，下游引物为5’-AGGGCTGCCTTCTCTTGT-3’(产物为161 bp)；bFGF的上游引物为5’-ACCGGTCACGGAAATACTCC-3’，下游引物为5’-CAAGCTCTACCACAGGGGAC-3’(产物为174 bp)；PKA的上游引物为5’-GGTGACAGACTTCGGTTTTGC-3’，下游引物为5’-TAACCAGCAGCCATCTCGT-3’(产物为90 bp)。反应条件为95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s，40个循环。根据 NTC 反应有无荧光信号检出，并结合熔解曲线确认反应体系是否有污染，以GAPDH作为内参照计算样品中 mRNA的相对表达量。

3统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)；两组数据间比较用两样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1一般情况

分别于实验前及实验第3、6、9、15天对脾气虚模型组大鼠体重进行测量，与实验前相比，随着造模时间的逐渐延长，脾气虚组大鼠体重明显下降(P<0.05)，见图1。同时大鼠伴随不同程度的皮毛粗糙、枯焦无光泽，乏力、蜷卧、游泳时间缩短，足蹼、鼻尖颜色淡红或苍白，以及厌食、便溏、喜扎堆等症状。

Figure 1.The change of body weight in rats with spleen-qi deficiency syndrome. Mean±SD.n=15.*P<0.05vsbefore modeling.

图1脾气虚模型组大鼠体重变化结果

2大鼠心功能的变化

与空白组比较，模型组大鼠心脏左室收缩末期容积明显升高(P<0.05)；模型组大鼠心脏的左室射血分数、左室舒张末期容积、左室每搏输出量明显降低(P<0.05)，结果见图2、表1。

Figure 2.The ultrasonic images of high-resolutioninvivoimaging system.

图2小动物超声影像结果

3心肌组织病理学检查

从HE染色结果可以看出，空白组大鼠心肌细胞横纹清晰，纤维结构清楚、排列整齐、无炎症细胞浸润；模型组大鼠部分心肌萎缩，细胞排列紊乱、部分细胞核溶解细胞坏死，出现炎症细胞浸润，存在细胞浑浊及脂肪变性，见图3。

4心肌中BNP的表达

Western blot法检测大鼠心肌组织中BNP蛋白表达的结果显示，模型组平均吸光度升高，BNP蛋白的表达增强(P<0.05)，见图4。

表1　小动物超声影像心功能变化结果

*P<0.05vscontrol group.

Figure 3.The pathological changes of cardiac muscle cells in the rats (HE staining, ×100).

图3大鼠心肌细胞组织病理学变化

5血清及心肌中BNP和cAMP含量

空白组与脾气虚模型组大鼠血清及心肌中BNP和cAMP含量测定结果显示，与空白组比较，模型组大鼠BNP和cAMP的含量在血清及心肌中均明显升高(P<0.05)，见表2。

6bFGF和PKA的mRNA表达

Real-time PCR的检测结果表明，目的基因的扩增曲线符合S型曲线，目的基因得到有效扩增。熔解曲线中显示只有一个峰值，没有出现杂峰，提示可以使用该体系对目的基因进行定量。模型组bFGF及PKA的mRNA表达水平明显高于空白组(P<0.05)，见表3。

Figure 4.Determination of BNP in the myocardium by Western blot. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol group.

图4Western blot法测定心肌中BNP

讨论

脾胃为后天之本，乃脏象学说的核心。脾，气血生化之源，主运化水谷，主统血即统摄、控制血液在脉中正常运行的作用，脾气虚则导致生血乏源。心主血，包括主行血的功能。《血证论》说：“守气者即是血”，血为气之母，血脉不充，气无依附，漂浮无根，故可见心气虚。心气虚，推动乏力；加之血脉空虚，导致患者正常生理功能的下降，可出现心功能及心射血能力下降。

脾虚证是中医较早开展研究的一个证候，而脾虚证动物模型的复制在脾虚证的研究中起着至关重要的作用。造模方法大体上有中医病因复制方法以及西医理化因素复制方法，方式上则有单因素、复合因素及多因素等[5]。但很多文献报道的方法在实施的过程中并没有得到理想的结果，利血平法虽效果显著，但属于理化因素复制，不符合中医的证候理论[6]。本研究在参照几种常用的脾虚造模方法，采用劳倦法外加饮食控制，希望以此确定既符合中医证的特点，又可复制的脾气虚证动物模型。造模后大鼠呈现皮毛粗糙、枯焦无光泽，乏力、蜷卧、游泳时间缩短，足蹼、鼻尖颜色淡红或苍白，以及厌食、便溏、喜扎堆等症状，说明造模成功。

表2　大鼠血清及心肌中BNP和cAMP含量

*P<0.05vscontrol group.

表3bFGF和PKA的 mRNA表达水平

Table 3.The mRNA expression levels of bFGF and PKA (Mean±SD.n=15)

GroupbFGFPKAControl1.26±0.051.03±0.12Model1.60±0.09*1.38±0.10*

*P<0.05vscontrol group.

脑钠肽是心室容量负荷和压力负荷增大时心肌细胞释放的一种激素，具有利钠、利尿、舒张血管作用，在心功能不全时可拮抗交感神经、抗利尿激素和肾素-血管紧张素-醛固酮系统等神经内分泌因素的过度激活，从而起到维护心功能的作用，机械性牵张是心肌细胞合成和分泌BNP的主要机制[7]。近年研究发现心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和BNP等神经内分泌激素水平在心脏负荷过重或心脏扩大时分泌增加[8]，BNP的合成主要在心室，心衰时室壁压力和张力增加会导致BNP释放增加[9]，所以体内ANP和BNP的含量可反映心脏的功能状态[10]。BNP己成为心力衰竭的血浆标记物，是目前心力衰竭检测惟一的实验室指标，已被欧洲心脏协会和美国心脏学会纳入心力衰竭的诊断标准[11]。

碱性成纤维细胞生长因子作为一种细胞有丝分裂原和促血管生成因子，是成纤维生长因子家族中的成员之一[12]。cAMP-PKA系统是介导机械刺激心肌细胞肥大的第2信号途径之一，且bFGF表达受cAMP的调控[13]。研究证明，压力超负荷可引起心肌细胞内cAMP浓度升高和bFGF表达[14]。

本研究中脾气虚证模型组大鼠体重明显下降，模型组大鼠心肌组织细胞发生不同程度坏死及变性，心输出量及射血分数均降低，血清及心肌中BNP和cAMP含量均升高，BNP蛋白表达及bFGF、PKA mRNA表达增加。脾气虚证心功能变化是通过何种信号通路改变鲜有报道，本研究以cAMP-PKA信号通路为设想：脾气虚引起心功能发生变化；机体分泌BNP增加生成的BNP与肌细胞膜受体结合产生cAMP；cAMP作为第2信使，激活PKA，使多种蛋白质磷酸化，并诱导心肌细胞bFGF mRNA及蛋白表达，产生细胞反应。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

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《中国病理生理杂志》编辑部

2016年2月15日

Effect of BNP- mediated cAMP-PKA signaling pathway on bFGF expression in rats with spleen-qi deficiency syndromeJIANG Xiao-lin, ZHANG Li-de

(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China.E-mail:zhldtcm@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the changes and the mechanism of heart functions in the rats with spleen-qi deficiency syndrome. METHODS: The rats were randomly divided into blank control group and spleen-qi deficiency model group. The changes of cardiac functions in the rats were determined by ultrasonic imaging with a high-resolutioninvivoimaging system. HE staining was used to observe the pathological changes. The protein expression of brain natriuretic peptide (BNP) in the myocardium was assessed by Western blotting. The contents of BNP and cAMP in the serum and myocardium were measured by ELISA. The mRNA expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) and protein kinase A (PKA) was detected by real-time PCR. RESULTS: Compared with blank control group, the myocardial cells in the model group had different degrees of necrosis and degeneration. Stroke volume and ejection fraction were decreased. The contents of cAMP and BNP in the serum and myocardium were increased in model group. The protein expression of BNP and the mRNA expression of bFGF and PKA were also increased.CONCLUSION: Spleen-qi deficiency syndrome causes heart function decline in rats. The expression of BNP, cAMP, PKA and bFGF is all increased.

[KEY WORDS]Spleen-qi deficiency syndrome; Heart function; Brain natriuretic peptide; Basic fibroblast growth factor

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.010

[中图分类号]R256.3; R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 024-31207078; E-mail: zhldtcm@163.com

*[基金项目]辽宁省教育厅创新团队项目(No. LT2014017)

[收稿日期]2015- 08- 04[修回日期] 2015- 09- 28

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0251- 05