咪达普利对氯化铵所致急性肺损伤大鼠血气、MDA及AngⅡ、CD54蛋白表达的影响

黄丛富，　郝雪琴，　邓　雯，　刘传发，　王婷婷，　温小利，　陶中蓉

(河南科技大学动物科技学院药学系，河南 洛阳 471003)



咪达普利对氯化铵所致急性肺损伤大鼠血气、MDA及AngⅡ、CD54蛋白表达的影响

黄丛富，郝雪琴△，邓雯，刘传发，王婷婷，温小利，陶中蓉

(河南科技大学动物科技学院药学系，河南 洛阳 471003)

[摘要]目的： 本研究通过复制氯化铵致大鼠肺损伤模型，研究咪达普利对肺损伤大鼠动脉血气、MDA、肺形态学和AngⅡ、CD54蛋白表达的影响。方法: 将30只雄性大鼠随机分为3组：空白对照组、肺损伤模型组和药物组。对照组大鼠腹腔注射生理盐水2 mL/kg；肺损伤模型组大鼠腹腔注射等量6%氯化铵；药物组大鼠在注射6%氯化铵后，每天1次灌胃咪达普利(3 mg/kg)，连续灌胃7 d；在实验第7天，用2%的戊巴比妥钠麻醉，采集腹主动脉血和腹腔静脉血样本；肺组织经4%多聚甲醛灌注、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片。ELISA法测定血清TNF-α和IL-6水平，化学发光法测定血清MDA含量，HE染色观察肺部形态学变化，免疫组织化学染色法观察肺组织AngⅡ和CD54蛋白表达。结果: 与对照组相比，模型组PaCO2明显升高(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6和MDA浓度显著增加(P<0.01)，氯化铵腹腔注射的肺损伤模型组大鼠出现肺水肿、肺炎、肺泡壁瘀血、肺泡腔出血和肺泡壁增生等损伤，肺组织AngⅡ和CD54蛋白表达明显增高(P<0.01)；与模型组比较，药物组PaCO2明显降低(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6和MDA浓度以及肺组织AngⅡ、CD54蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论: 咪达普利可显著改善氯化铵所致肺损伤大鼠血气，抑制脂质过氧化和血清炎症细胞因子，降低肺组织AngⅡ和CD54蛋白表达。

[关键词]咪达普利； 急性肺损伤； 氯化铵

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是指由各种肺内外致病因素中的心源性以外的因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭，并伴随一系列严重的肺部炎症过程[1-2]。作为临床急症之一，其发病迅速，病因复杂，抢救困难，致死率高。ALI的病因多达百余种，可以分为直接病因和间接病因。溺水、误吸入毒物、肺挫伤和肺感染等构成直接病因；脓毒血症、肺部外的严重创伤、休克、外科手术、重症胰腺炎和全身严重感染等构成了间接病因[3]。急性肺损伤加重则发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。目前的治疗手段多为对症治疗，尚未有特效药物。有研究表明，咪达普利(imidapril)对吸入性肺炎有较好的预防作用，它通过抑制血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)活性阻断血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)的生成[4]，从而起到预防和缓解损伤肺、消除炎症反应的作用。因此，本实验进一步研究了咪达普利对ALI的治疗作用以及对血气指标、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、AngⅡ和CD54蛋白表达及相应炎症因子的影响。

材料和方法

1实验动物分组及模型制备

30只SPF级雄性SD大鼠，由华中科技大学同济学院实验动物中心提供，合格证号为SCXK(鄂)2010-0007，饲养于河南科技大学动物牧场，大鼠笼和所用器皿等均严格消毒，将SD大鼠雄鼠随机平均分成3组：对照组、模型组和药物组。对照组大鼠腹腔注射生理盐水2 mL/kg；肺损伤模型组大鼠腹腔注射等量6% NH4Cl[5-6]；药物组大鼠在注射6% NH4Cl 后，每天1次灌胃咪达普利(3 mg/kg)，连续灌胃7 d；在实验第7天，用2 %的戊巴比妥钠麻醉，采集腹主动脉血和腹腔静脉血样本；肺组织经4%多聚甲醛灌注、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片。

2观察指标与实验方法

2.1血气及TNF-α、IL-6和MDA浓度的测定采集的动脉血在洛阳市中心医院呼吸科于37 ℃下测定pH、PaCO2、PaO2、Na+、K+、Ca2+、Hct等参数；静脉血在3 000 r/min离心分离血清后用ELISA试剂盒特异性显色，用多功能酶标仪测定TNF-α和IL-6的浓度，化学发光法测定MDA浓度。

2.2HE染色取固定好的大鼠肺脏用手术刀修块，从低到高梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后切片，染色前将切片于60 ℃烘箱烤片30 min，二甲苯中脱蜡，从高到低梯度乙醇浸泡复水，苏木精染液染色5 min，自来水稍洗，1%盐酸乙醇溶液分化5～10 s，自来水洗返蓝，0.5%伊红(水溶性)染色2 min，由低到高梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下观察并拍照。

2.3免疫组化染色将制作好的切片60 ℃烤片1 h，二甲苯脱蜡，高浓度乙醇到低浓度乙醇水化，3% H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶；电磁炉进行热抗原修复暴露抗原决定簇，冷却后PBS冲洗2～3次，于湿盒中用5%的BSA室温封闭非特异性蛋白20 min，甩去余液，滴加 I 抗，4 ℃孵育过夜；PBS水洗3次，II 抗37 ℃孵育30 min；PBS水洗后滴加SABC复合物37 ℃反应20 min，DAB显色后双蒸水终止反应，滴加苏木精染液对细胞核进行衬染，1%盐酸乙醇分化并用自来水蓝化，由低到高梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封片，在显微镜下观察。

2.4图像处理采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，每组免疫组化后的肺切片选取8张图片，获取肺组织AngⅡ和CD54蛋白表达的积分吸光度(IA)。

3统计学处理

各组计量资料以均数±标准误(mean±SEM)表示，采用SPSS 19.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比较用Tukey法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1咪达普利对急性肺损伤大鼠血气指标的影响

与对照组比较，氯化铵诱导的急性肺损伤模型大鼠PaCO2明显升高(P<0.05)；与模型组比较，咪达普利药物组能明显降低氯化铵诱导的急性肺损伤模型大鼠的PaCO2(P<0.05)，见表1。

2咪达普利对急性肺损伤大鼠血清TNF-α、IL-6和MDA浓度的影响

与对照组比较，氯化铵诱导的急性肺损伤模型大鼠血清中TNF-α、IL-6和MDA的浓度显著增加(P<0.01)；与模型组比较，咪达普利药物组能显著降低大鼠血清中TNF-α、IL-6和MDA的浓度(P<0.01)，见图1、表2。

表1　各组血气指标测定结果

*P<0.05vsmodel group.

Figure 1.Comparison of serum concentrations of TNF-α, IL-6 and MDA in each group. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vsmodel.

图1各组血清中TNF-α、IL-6和MDA浓度的比较

3咪达普利对急性肺损伤形态学的影响

肺组织形态学检查结果显示，与对照组相比，肺损伤模型组支气管周围蓝染细胞聚集较多，以I型肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤为主，肺泡间质水肿伴大量炎症细胞渗出，可见实变及肺泡塌陷及透明膜形成，有明显的炎症细胞(单核巨噬细胞、淋巴细胞和白细胞)浸润，尤其是在支气管附近，而且在肺泡壁内有大量红细胞，瘀血严重，另外，肺泡壁厚度也明显增加，有增生现象；与肺损伤模型组相比，药物治疗组I型肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤程度减轻，药物组肺泡壁的厚度明显变小，而且厚度与对照组相当，增生现象减弱或消失，肺泡腔和肺泡壁中的红染相对较少，红细胞渗出不太明显，出血或瘀血现象在一定程度上得到控制，见图2。

4咪达普利对急性肺损伤大鼠肺组织AngⅡ表达的影响

免疫组化染色后经苏木精衬染，可见蓝紫色细胞核。与对照组相比，模型组大鼠肺组织棕色颗粒表达最多，表现为胞体外形肥大，突起变短增粗，染色加深；药物组阳性表达相对较少，棕色颗粒数目有很大程度地下降，见图3。

Figure 2.Morphology change of lung tissue in each group (HE staining,×400).

图2各组大鼠肺脏形态学损伤表现

Figure 3.Immunohistochemical detection for Ang Ⅱ expression in lung (×400). Mean±SEM.n=10.**P<0.01vsmodel.

图3免疫组化显示肺脏Ang Ⅱ的表达

5咪达普利对急性肺损伤CD54蛋白表达的影响

免疫组化染色图片显示，CD54蛋白主要分布于肺血管内皮细胞和支气管上皮细胞的胞膜和胞浆中，经免疫组化染色，细胞核蓝染，核周围呈现棕染。对照组出现少量的棕染；模型组染色加深,阳性表达增多，药物组阳性表达相对较少，棕色颗粒数目有很大程度的下降。与对照组相比，氯化铵模型组CD54蛋白阳性表达显著增多(P<0.01)；与氯化铵组相比，咪达普利组CD54蛋白阳性表达显著减少(P<0.01)，表明用氯化铵腹腔注射大鼠引发炎症反应使肺组织中的CD54蛋白表达增多，而咪达普利灌胃大鼠减轻炎症反应而使得肺组织中CD54蛋白表达减少，见图4。

讨论

随着人口中国老龄化的加大和突发新发疾病的增多，ALI/ARDS作为危重病领域的难题，寻找更多更有效的治疗途径已经激发了研究者们的浓厚兴趣。ALI/ARDS引发局部肺组织水肿、充血、出血及凝血[7]，肺泡塌陷，肺毛细血管膜损伤及伴随肺间质的纤维化，临床表现呼吸频数增加，呼吸窘迫，顽固性低氧血症，胸部X线显示双肺弥漫性浸润，易并发多器官衰竭[8]。与正常组相比，ALI/ARDS模型血清中TNF-α含量明显升高。TNF-α作为巨噬细胞的功能蛋白，能够特异性反映巨噬细胞分布的变化。TNF-α对肺脏有一定的毒性，它能够增加肺组织血管通透性，活化内皮细胞，组织中TNF-α浓度的增加使肺组织损伤加剧[9-10]。因此，在组织病理学层面，观察肺组织形态的变化，测定巨噬细胞的分布和细胞因子的浓度，能够了解肺部组织的炎症和损伤情况。

早期的ALI病理表现为肺血气屏障通透性增高，肺泡与肺间质内积聚有大量的水肿液，水肿液中含多种炎症细胞，其中中性粒细胞占主要成分。附着在损伤的血管内皮细胞表面的中性粒细胞，逐渐移向肺间质和肺泡腔中，并释放大量炎症细胞因子(TNF-α、IL-6等)和过氧化物等，这些炎症介质进一步诱导了肺损伤。除此之外，凝血和纤溶发生的紊乱也加重了ALI的病程，引发血管栓塞以及微循环结构受损[7]。

Figure 4.Immunohistochemical detection for CD54 protein expression in lung (×400). Mean±SEM.n=10.**P<0.01vsmodel.

图4免疫组化显示肺脏CD54蛋白的表达

本实验中，血气指标显示，我们构建的模型组PaCO2有所升高(P<0.05)，动脉血液中CO2分压的升高说明肺脏气体交换效率降低，影响机体换气功能；同时300>P/F>200(PO2/FiO2≈ 278，FiO2=0.21)，实验应用NH4Cl 8 h后取组织，损伤建立时间小于1周，依据柏林诊断标准[11-13]，该模型已构成轻度ALI，实验建模成功。在药物组，PaCO2明显降低，表明肺脏气体交换能力得到一定改善。咪达普利对ALI引发的PaCO2升高产生了明显的缓解作用，这可能是咪达普利通过抑制脂质过氧化和肺部炎症反应，提高血氧结合比，从而改善肺部功能。

通过免疫组化实验，我们发现模型组AngⅡ和CD54阳性表达比对照组显著增多(P<0.01)。NH4Cl使血管通透性增加，引发水肿、充血和出血，这些炎症变化使血浆中的单核细胞透过血管壁进入肺组织中转变为AM，肺组织中的AM大量聚集，AngⅡ和CD54阳性表达增多。咪达普利组AngⅡ和CD54表达与模型组相比显著降低，可能的原因是咪达普利在体内代谢成咪达普利拉，后者抑制了ACE活性，使AngⅡ生成减少[17]，AngⅡ对AP-1和NF-κB的激活能力相应减弱，NF-κB对细胞因子、黏附分子等基因转录的促进作用相应减弱，使单核细胞转变成AM的数量减少[18-19]。

综上所述，NH4Cl增加血管壁通透性，导致组织水肿、充血、出血、炎症细胞(巨噬细胞)渗出增多，I型肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤，AngⅡ和CD54蛋白表达增高；炎症使肺泡壁增厚，血气交换降低，同时激活了RAS，使肺部脂质过氧化增强，MDA生成增多。咪达普利通过发挥ACEI作用，降低RAS活性，抑制脂质过氧化和肺部炎症反应，使单核细胞向AM转化减少，血氧结合比提高，肺功能得到一定程度改善。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effects of imidapril on blood gas, oxidative stress and inflammatory factors in rats with acute lung injury induced by ammonium chlorideHUANG Cong-fu, HAO Xue-qin, DENG Wen, LIU Chuan-fa, WANG Ting-ting, WEN Xiao-li, TAO Zhong-rong

(DepartmentofPharmacy,CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luo-yang471003,China.E-mail:haohaoxq@139.com)

[ABSTRACT]AIM: In this study, the rat lung injury model was induced by ammonium chloride for studying the effect of imidapril on blood gas, serum TNF-α, IL-6 and MDA concentrations, and AngⅡ and CD54 protein expression in rat lung tissue. METHODS: Male rats were randomly divided into 3 groups: control group, lung injury model group and drug group. The rats in control group were given saline (2 mL/kg), while the rats in lung injury model group were given 6% ammonium chloride (2 mL/kg). In drug group, imidapril (3 mg·kg-1·d-1) was given to the rats once daily for 1 week by intragastric gavage after given 6% ammonium chloride. On the 7th day, the rats were anesthetized with 2% so-dium pentobarbital. Abdominal aorta blood, venous blood and lung tissue were collected. The blood gas indexes and serum TNF-α, IL-6 and MDA concentrations were determined. The lung tissues were fixed and sliced, and the expression of AngⅡ and CD54 proteins was detected by immunohistochemistry. RESULTS: The PaCO2increased in lung injury model group compared with control group and drug group (P<0.05).The expression of AngⅡ and CD54, and the concentrations of TNF-α, IL-6 and MDA also increased significantly (P<0.01) in model group. Pulmonary edema, inflammation, alveolus congestion, hemorrhage and hyperplasia in model group were obvious compared with control group and drug group. CONCLUSION: Imidapril improves blood gas indexes, and reduces lipid peroxidation and inflammatory responses in the rats with lung injury induced by ammonium chloride.

[KEY WORDS]Imidapril; Acute lung injury; Ammonium chloride

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.015

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel： 0379-64280319； E-mail: haohaoxq@139.com

[收稿日期]2015- 08- 06[修回日期] 2015- 10- 09

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0278- 06