二苯乙烯苷对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠脑内β淀粉样前体蛋白及分拣蛋白相关受体1 mRNA表达的影响

杨晓颖　刘　宁　黄岑汉　刘燕平　黄炳臣　黄永秩　黄忠仕

(广西中医药大学，广西　南宁　530000)



二苯乙烯苷对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠脑内β淀粉样前体蛋白及分拣蛋白相关受体1 mRNA表达的影响

杨晓颖刘宁1黄岑汉1刘燕平黄炳臣1黄永秩1黄忠仕1

(广西中医药大学，广西南宁530000)

〔摘要〕目的研究二苯乙烯苷(TSG)对APP/PS1双转基因小鼠脑内β淀粉样前体蛋白(APP)及分拣蛋白相关受体(SORL)1表达的影响。方法3月龄APP/PS1双转基因鼠50只，随机分为模型组、阳性药石杉碱甲组、TSG高、中及低(0.3，0.1，0.033 g/kg ) 剂量组，另取同龄C5B7L/6J鼠10只为正常对照组。各组给予相应药物60 d后，采用苏木素-伊红(HE)染色法观察小鼠海马神经元的一般结构；免疫组化SABC法检测各组小鼠脑组织APP蛋白的表达。FQ-PCR法检测SORL1 mRNA表达情况。结果与模型组比较，各组小鼠大脑皮层及海马区形态均有不同程度恢复;APP表达量均下降(P<0.01，P<0.05);SORL1 mRNA表达均有所上调(P<0.05)。结论TSG治疗阿尔茨海默病(AD)的机制可能与促进SORL1 mRNA生成、抑制APP异常代谢、减少老年斑的生成等机制有关。

〔关键词〕二苯乙烯苷；阿尔茨海默病；β淀粉样前体蛋白；分拣蛋白相关受体1

1右江民族医学院

第一作者：杨晓颖(1990-)，女，在读硕士，主要从事中医诊治与辨证的客观化规范化研究。

虽然阿尔茨海默病(AD)的发病机制尚未完全明确，但越来越多的研究证明，β淀粉样蛋白(Aβ)的聚集在AD的发生、发展过程中起了关键作用〔1〕。2007年Rogaeva等〔2〕首次提出Sortilin相关受体基因分拣蛋白相关受体(SORL)1可能是AD患病的相关风险因子，其机制与SORL1调控Aβ的相关代谢途径、参与淀粉样前体蛋白(APP)裂解环节有关。本实验拟探讨二苯乙烯苷(TSG)治疗AD的作用及APP和SORL1在致病过程中可能的作用机制。

1材料与方法

1.1动物APP/PS1双转基因小鼠和同遗传背景C5B7L/6J小鼠。雄性，体重26~30 g，SPF级，均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供〔动物质量许可证号：SCXK(京)2014-0004〕。

1.2主要试剂TSG(成都克洛玛生物科技有限公司，批号 14112)，石杉碱甲(河南太龙药业股份有限公司，批号：H10940156)。一抗：APP兔抗鼠多克隆抗体(abcam公司，编号：ab15272)，二抗：二步法免疫组化检测试剂盒;DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。总RNA提取试剂盒(TaKaRa,Code No.9767)，逆转录试剂盒(TaKaRa,Code No.RR047A),实时荧光定量试剂盒(TaKaRa,Code No.RR820A),均购自大连宝生物有限公司。

1.3主要仪器HMIAS-2000W高清晰度彩色医学图文分析管理系统(右江民族医学院附属医院病理科提供，型号：LOGENE-I)。超微量分光光度计(德国IMPLEN公司，型号：Nanophtoometer Pearl360)，全自动凝胶成像系统(培清科技，型号：JS-680B)，电泳仪(北京六一仪器厂，型号：DYY-6D)普通梯度PCR仪(美国BIO-RAO公司，型号：PTC-200)，Real Time PCR仪(美国BIO-RAO公司，型号：IQ5)。

1.4动物分组与给药3月龄APP/PS1双转基因雄性小鼠50只，随机分为模型组、阳性对照药石杉碱甲组及TSG高、中、低剂量组，每组10只。另外，选择3月龄C5B7L/6J雄性小鼠10只作为正常对照组。模型组、正常对照组：生理盐水，30 ml/kg；石杉碱甲组0.15 mg/kg；TSG高、中、低剂量组：TSG各组剂量依次为0.3，0.1，0.033 g/kg。以上各组每日灌胃给药1次，连续60 d。

1.5检测指标标本制备：治疗结束后，冰上迅速取出小鼠脑组织，放入10%甲醛固定1 w。石蜡包埋、切片，60℃烤箱内烘烤2 h后，常温保存以备进行后续实验。

1.5.1苏木素-伊红(HE)染色脱蜡、梯度酒精脱水各5 min、苏木素染色5 min，水洗。1%盐酸乙醇分化数秒，水洗返蓝。伊红染色1 min后，水洗。梯度酒精脱水透明，中性树胶封片。显微镜下观察。

1.5.2免疫组化染色石蜡切片常规脱蜡复水，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液沸水煮2 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，2次/min，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，PBS冲洗3×2次/min，山羊血清封闭室温孵育15 min(勿洗，甩干即可)。滴加APP兔抗鼠多克隆抗体(均按1∶100稀释)，4℃ 孵育过夜，PBS冲洗3×2次/min。聚合物辅助剂室温孵育20 min，辣根酶标记物山羊抗兔/小鼠IgG多聚体室温25 min。DAB显色、苏木素轻度复染、常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组化阳性细胞的测定方法：各组随机选取小鼠脑组织切片4张，每张切片在大脑皮层和海马区各取5个视野(400倍)，观察计算每个视野内染为棕色的APP的阳性细胞数。总和除以5作为该小鼠的阳性细胞的计数。

1.5.3FQ-PCR取含海马区的小鼠脑组织，液氮研磨后提取总RNA，紫外分光光度计分析及琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度、纯度、完整性。根据cDNA逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。引物由大连宝生物有限公司设计合成。PCR反应条件：①SORL1：上游引物 5′-GATGCGGATTGCCAGGATG-3'，下游引物5'-ATGCTTGCTGGACGGGATG-3',②GAPDH:上游引物5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物5'-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3'。 SYBR@ R Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA模板2 μl，加dH2O至总反应体系为20 μl。反应条件：(二步法扩增条件)：SORL1、GAPDH的扩增，第一步：预变性，95℃ 30 s，1个循环；第二步:95℃，5 s，61℃，30 s，共40个循环；55℃，30 s，共81个循环。通过2-△△CT法表示目的基因mRNA的相对表达水平。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳。

1.6统计学处理采用SPSS17.0软件，多组计量资料采用ANOVA检验，多样本均数的两两比较采用SNK检验。

2结果

2.1神经病理形态学观察正常组小鼠大脑皮层和海马形态完整，神经元数量多、结构致密、分布均匀，鲜见细胞空泡变性及坏死。模型组小鼠大脑皮层和海马区神经元细胞明显减少，同时可见多处细胞体积缩小，胞核固缩，染色加深，并伴有大量的小胶质细胞增生。与模型组相比，各治疗组脑皮层及海马区形态均有不同程度恢复。

2.2APP免疫组化结果阳性反应细胞呈圆形或椭圆形，可见胞质内充满棕黄色颗粒，部分邻近胞膜处染色较深。阳性细胞在正常对照组也有弱表达，与正常对照组比较，模型组大脑皮层及海马区APP蛋白表达明显增多(P<0.01),与TSG高、中、低剂量组和石杉碱甲组相比表达量无明显变化(P>0.05)。与模型组相比，石杉碱甲组和TSG高、中、低各剂量组大脑皮层和海马区APP阳性表达量均明显减少(P<0.05或P<0.01)，其中TSG高剂量组下降最为明显；与石杉碱甲组相比，TSG各剂量组表达无统计学意义(P>0.05)，见表1，图1，图2。

表1　TSG对各组小鼠大脑皮层及

与模型组比较:1)P<0.05,2)P<0.01

图1　海马区APP表达免疫组化结果(×400)

图2　大脑皮层APP表达免疫组化结果(×400)

2.3SORL1 FQ-PCR结果与正常对照组(1.288±0.681)相比，模型组SORL1 mRNA表达量(0.854±1.45)明显减少(P<0.01),与TSG高、中、低剂量组(分别为1.03±0.108、1.023±0.603、1.021±0.173)和石杉碱甲组(1.043±0.986)相比表达量无明显变化(P>0.05)；与模型组相比，TSG高、中、低剂量组和石杉碱甲组，SORL1 mRNA表达量均上调(P<0.05)；与石杉碱甲组相比，TSG各剂量组mRNA表达均无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

SORL1基因位于第11号染色体上，是一种脂蛋白受体同源体，主要表达于中枢神经系统，在大脑皮质的椎体细胞、小脑浦肯野细胞和海马区亦有高表达〔3〕。SORL1作为APP的一种选择性蛋白受体，能辅助APP在细胞内进行物质转运。SORL1与APP结合后，能明显降低APP被β-水解酶水解成Aβ的可能性〔4〕。Aβ是AD主要病理改变老年斑的核心成分和中心环节〔5，6〕。APP作为Aβ的前体蛋白，合成后约有10%会成为跨膜蛋白，其余的大部分在细胞内被分泌酶水解〔7〕。正常情况下，APP的主要代谢途径为α途径。在APP发生基因突变、缺氧、氧化应激、炎症等病理情况下，APP由α代谢途径转变为β、γ代谢途径，α分泌酶表达减弱，β分泌酶和γ分泌酶表面活性增强，是导致Aβ沉积的主要原因〔8，9〕。Aβ级联学说认为，在AD病人脑组织中，由于Aβ大量沉积，引发炎症、氧化应激和神经元丢失，并引起tua蛋白异常磷酸化、轴突损伤和突触丢失从而导致病人失去认知能力〔10〕，降低Aβ在大脑内的蓄积量可延缓或减轻AD的症状〔11〕。研究表明SORLl可使APP重新分配，减少APP在γ分泌酶水平上的分解，从而减少Aβ的生成。

TSG是中药何首乌的主要水溶性成分，有较好的抗衰老、神经保护、降血脂及抗动脉硬化等作用〔12，13〕。TSG的神经保护作用，其作用机制可能通过钙通道拮抗作用、抗氧化作用、胆碱酯酶抑制剂作用、调节细胞凋亡和延缓衰老等途径而对脑神经起到保护作用〔14〕。TSG能清除和抑制老年斑的生成，保护脑组织海马神经元的完整性和促进神经元树突的生长〔15〕。临床运用中发现何首乌可明显改善AD患者的记忆能力，其作用机制可能是多靶点、多途径、多环节的。

海马是获取和巩固信息有关回路的一个重要组成部分，特别是近事记忆，因此海马参与储存记忆的神经过程〔16〕。同时，海马也是AD最先病变的脑区之一。本实验结果显示，经治疗后TSG各剂量组和石杉碱甲组小鼠大脑皮层和海马区神经细胞均有不同程度恢复，APP蛋白阳性表达量均有所下降，SORL1基因表达均有所上调，两者都以TSG高剂量组治疗效果最为明显，说明TSG高剂量组可能是治疗AD的有效剂量，达到了较理想的血药浓度。根据以上结果推断TSG能够起到保护神经细胞，减缓细胞凋亡进程，减少老年斑的沉积作用。其机制可能与促进SORL1的生成，抑制APP的异常代谢途径有关，并有可能是在提高SORL1生成基础之上继而对APP的异常代谢途径产生影响，但也可能为共同作用于两者产生协同作用有关。

4参考文献

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〔2015-12-02修回〕

(编辑李相军)

Effect of TSG on protein expression of APP in APP/PS1 double transgenic AD mice brain tissues

YANG Xiao-Ying,LIU Ning,HUANG Cen-Han,etal.

Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning 530000,Guangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of TSG on gene expression of β-amyloid precursor protein(APP)and sortilin-related receptor 1(SORL1)in APP/PS1 double transgenic mice brain tissues.MethodsFifty three-months-old APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into model,huperzine A,high-,mid- and low-dose groups of TSG(0.3,0.1,0.033 g/kg),with 10 mice in each group,and another 10 same age C5B7L/6J mice as normal control group.After medication corresponding drugs for 60 days,HE staining was used to observe the general structure of hippocampal neurons,the expression of APP in brain tissue was assayed by immunohistochemical SABC method,and FQ-PCR method was used to detect the expression of SORL1 mRNA.ResultsCompared with those of model group,the cerebral cortex and hippocampus in each group were recovered in different degree,the protein expression of APP was down-regulated(P<0.01,P<0.05),the expression of SORL1 mRNA was up-regulated(P<0.05).ConclusionsTSG has a certain preventive and therapeutic effect on AD that might be related to promoting the generation of SORL1 mRNA,inhibition of the protein expression of APP and reducing the formation of senile plaques.

【Key words】2,3,5,4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside(TSG);Alzheimer's disease;β-amyloid precursor protein(APP);Sortilin-related receptor 1(SORL1)

通讯作者：黄忠仕(1970-)，男，博士，教授，主要从事抗痴呆药物研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81260495)；广西自然科学基金资金项目(2013GXNSFAA019212)

〔中图分类号〕R749.1+6

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0536-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.009