甘草酸二铵对胰腺癌BxPC-3细胞株的影响

张英博　费洪新　仲丽丽　张晓杰

(齐齐哈尔医学院，黑龙江　齐齐哈尔　161006)



甘草酸二铵对胰腺癌BxPC-3细胞株的影响

张英博费洪新仲丽丽1张晓杰

(齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔161006)

〔摘要〕目的探讨甘草酸二铵(DG)对胰腺癌BxPC-3细胞株的影响。方法胰腺癌BxPC-3细胞株随机分成对照组，5-氟尿嘧啶(5-FU)组(50 μg/ml)，DG高、低剂量组(48，24 μg/ml)。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测胰腺癌BxPC-3细胞株的增殖抑制率；采用细胞划痕法检测胰腺癌BxPC-3细胞株的运动能力；电子显微镜观察胰腺癌BxPC-3细胞株镜下形态结构；采用免疫组化和RT-PCR检测胰腺癌BxPC-3细胞株中Raf-1水平。结果与对照组比较，5-FU组及DG高、低剂量组细胞OD值明显降低(P<0.05)，运动能力明显降低(P<0.05)，胰腺癌BxPC-3细胞株形态结构明显损伤，Raf-1水平明显降低(P<0.05)。结论DG通过抑制Raf-1在胰腺癌治疗中发挥重要作用。

〔关键词〕甘草酸二铵；胰腺癌；细胞株

1黑龙江中医药大学中医学博士后科研流动站在站人员

第一作者：张英博(1973-)，男，博士，副主任医师，主要从事肿瘤、肝纤维化、痴呆研究。

胰腺癌发病与Raf-1-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的刺激有关。Raf-1为一种MAPK激酶激酶(MAPKKK)，其作用是磷酸化并激活下游底物MAPK激酶(MAPKK)，MAPKK可以磷酸化后激活下游底物(ERK1/2)，显示Raf-1是胰腺癌的一种重要的靶点之一〔1〕。中药甘草中最主要的活性成分之一是甘草酸。甘草酸可抑制人脑胶质瘤U251细胞的作用〔2〕，具有抗氧化、抗感染、抗病毒、抗肿瘤的广泛作用〔3〕。甘草酸二铵(DG)是甘草酸相关的有效活性成分之一，可以通过核转录因子(NF)-κB途径改善神经炎症反应而治疗阿尔茨海默病〔3〕，具有神经保护功能〔4〕，并对溃疡性结肠炎大鼠模型有抗感染作用〔5〕。虽然DG的治疗作用非常广泛，但是国内外关于DG抗胰腺癌的研究尚属于空白。本实验旨在研究DG对胰腺癌BxPC-3细胞的抑制作用及其对胰腺癌发病关键位点蛋白的影响。

1材料与仪器

1.1药物和细胞株DG由正大天晴药业集团股份有限公司生产，批号141202102；5-氟尿嘧啶(5-FU)由Sigma公司提供；人原位胰腺癌BxPC-3细胞株，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.2试剂与仪器改良型RPMI-1640培养基和消化胰酶(HyClone公司)，Trizol试剂盒和DEPC(上海生工生物工程)，胎牛血清(HyClone公司)，兔抗人Raf-1单克隆抗体(美国Bioworlde公司)，其他试剂均为国产或者进口分析纯。HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)，CO2培养箱(力康发展公司)，倒置显微镜(Philippines公司)，医用型洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，超级恒温槽(上海一恒科学仪器有限公司)，H1650-W型高速离心机(湖南湘仪公司)，实时定量PCR检测仪(美国伯乐公司)，液氮生物容器(成都金凤液氮容器有限公司)等。

1.3方法

1.3.1细胞培养胰腺癌BxPC-3细胞，在5%CO2、37℃培养箱中恢复生长至对数生长期，冻存胰腺癌BxPC-3细胞，开始前期实验。正式复苏胰腺癌BxPC-3细胞，用含10%胎牛血清、1%双抗的改良型RPMI-1640培养液于培养瓶中传代培养，观察胰腺癌BxPC-3细胞的状态。胰腺癌BxPC-3细胞均处于对数生长期后，开始后面的实验。

1.3.2细胞分组及处理消化传代状态良好的胰腺癌BxPC-3细胞随机分成对照组(予无菌生理盐水)、5-FU组(予5-FU 50 μg/ml)、DG高剂量组(予DG 48 μg/ml)、DG低剂量组(予DG 24 μg/ml)。

1.3.3四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测胰腺癌BxPC-3细胞的增殖抑制率取各组对数生长期胰腺癌BxPC-3细胞，常规消化制成单细胞悬液，调整BxPC-3细胞浓度为每ml含有2×105个细胞，接种于96孔培养板，保持每孔1×104个细胞，1 d后进行DG干预，5%CO2、37℃培养箱孵育3 d，倒置显微镜下观察胰腺癌BxPC-3细胞。加入MTT及二甲基亚砜(DMSO)，用6100型RT-雷杜酶标仪在波长为490 nm处检测各孔的吸光度(OD)，计算DG对BxPC-3细胞的增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3.4细胞划痕法检测胰腺癌BxPC-3细胞的运动能力黑色笔在6孔培养板背后，每隔0.5~1 cm划横线，每孔至少穿过3条线。在每孔中加入约5×105个胰腺癌BxPC-3细胞，培养24 h后，垂直于背后横线画划痕。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞每孔3次，以去除划下的细胞。对照组加入正常完全培养基、5-FU组加入含有5-FU 50 μg/ml完全培养基、DG高剂量组加入含有DG 48 μg/ml完全培养基、DG低剂量组加入含有DG 24 μg/ml完全培养基，继续培养48 h。按0、24、48 h取样拍摄划痕处，测量划痕的距离，细胞运动能力可使用愈合百分比进行评价。愈合百分比(%)=(1-48 h划痕距离/0 h划痕距离)×100%。

1.3.5透射电镜检测胰腺癌BxPC-3细胞的超微结构胰腺癌BxPC-3细胞实验结束后，收集各组细胞，以每瓶培养的细胞为观察对象，离心获得细胞团块，戊二醛固定、四氧化锇固定、脱水、包埋、切片等过程，电子显微镜观察DG处理胰腺癌BxPC-3细胞的超微结构。

1.3.6免疫组化检测BxPC-3细胞Raf-1蛋白的表达选择各组BxPC-3细胞，离心后接种到载玻片中，待细胞贴壁后选择各载玻片。按照免疫组织化学试剂盒说明书，采用SP法开始实验。在400倍显微镜下计数棕色细胞的光密度值，每组选出6个不同视野，采用HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统进行分析，计数每组光密度值进行比较。

1.3.7实时定量PCR法检测BxPC-3细胞Raf-1 mRNA的表达按Trizol抽提试剂说明书进行细胞总RNA的提取并计算浓度。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。Raf-1引物：上游：5′-GTG GAT GAT GCC TTT GCT CG-3′，下游：5′-CCA TCG GCG TTC CCA TAC TT-3′；GAPDH引物：上游：5′-AAC GGA TTT GGT CGT ATT GG-3′，下游：5′-TGG AAG ATG GTG ATG GGA TT-3′。将目的RNA和引物充分混匀后短暂离心，反应条件：95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s，共进行40个循环。收集荧光，反应结束后，使用iQTM5软件分析PCR过程各检测样本的Ct值，结果是目的基因(Raf-1)相对于内参基因(GAPDH)的表达量。

1.4统计学方法应用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1DG对胰腺癌BxPC-3细胞增殖抑制率的影响与对照组(0.822 7±0.107 2)比较，5-FU组(0.652 7±0.078 4)、DG高剂量组(0.393 8±0.074 6)、DG低剂量组(0.626 9±0.077 4)BxPC-3细胞OD值明显降低(P<0.05)。5-FU组、DG高、低剂量组胰腺癌BxPC-3细胞增殖抑制率分别为(20.67±9.53)%、(52.14±9.07)%、(23.80±9.40)%。

2.2DG对胰腺癌BxPC-3细胞运动能力的影响与对照组比较，5-FU组、DG高剂量组、DG低剂量组BxPC-3细胞48 h划痕距离明显增加(P<0.05)，愈合百分比明显降低(P<0.05)。见表1。

表1　DG对胰腺癌BxPC-3细胞运动能力的影响

与对照组比较：1)P<0.05

A：对照组；B：5-FU组；C：DG高剂量组；D：DG低剂量组；下图同图1　DG对人胰腺癌BxPC-3细胞的影响(透射电镜，×6 500)

图2　DG对人胰腺癌BxPC-3细胞的影响(透射电镜，×16 500)

2.3DG对胰腺癌BxPC-3细胞超微结构的影响见图1，图2。对照组：电镜下可见胰腺癌BxPC-3细胞呈椭圆形，排列十分紧密，均匀分布，间隙正常，细胞质丰富，细胞核椭圆形，核膜较清晰，核仁明显，细胞核染色质均匀分布，细胞质内线粒体，粗面内质网结构清晰，游离核糖体丰富。5-FU组：胰腺癌BxPC-3细胞形态较小，体积明显变小，细胞核较小，细胞膜凹陷不完整，细胞间隙增大，核染色质高度凝集、固缩于核膜下，部分细胞核碎裂、崩解，细胞质密度增高，细胞质内细胞器较少，线粒体轻度肿胀。DG高剂量组：胰腺癌BxPC-3细胞形态不规则，细胞核较小，细胞核碎裂、崩解，核染色质高度浓缩边集，细胞膜融合，细胞边界不清，线粒体空泡状改变，部分细胞器结构消失，微绒毛脱落，细胞质内细胞器较少。DG低剂量组：胰腺癌BxPC-3细胞形态不规则，细胞核较小，细胞核内异染色质轻度凝集，细胞质细胞器不丰富，线粒体有不同程度的肿胀，部分线粒体嵴断裂、消失，微绒毛脱落，粗面内质网略有扩张且数量明显减少，溶酶体增多，游离核糖体较少。

2.4DG对胰腺癌BxPC-3细胞Raf-1光密度值的影响与对照组(0.502 2±0.052 6)比较，5-FU组(0.248 7±0.030 1)、DG高剂量组(0.287 8±0.028 8)、DG低剂量组(0.352 9±0.036 9)胰腺癌BxPC-3细胞Raf-1光密度值明显降低(P<0.05)。

2.5DG对胰腺癌BxPC-3细胞Raf-1 mRNA的影响与对照组(0.988 0±0.186 6)比较，5-FU组(0.359 5±0.262 2)、DG高剂量组(0.415 9±0.180 2)、DG低剂量组(0.641 1±0.134 2)胰腺癌BxPC-3细胞Raf-1 mRNA表达量明显降低(P<0.05)。

3讨论

肿瘤的发生与细胞内众多信号传导通路密切相关。Ras/Raf/MEK/ERK信号级联通路是与肿瘤相关的信号通路之一，例如Raf-1与细胞外信号调节激酶(ERK)在胃腺癌中高表达〔6〕，核心蛋白聚糖通过Ras/Raf信号通路对HepG2 细胞有抑制作用〔7〕，MAPK 信号通路参与遗传性多囊肾的发病机制〔8〕。Ras/Raf/MEK/ERK通路参与了细胞增殖、生长、发育、分化以及细胞间的功能同步和细胞恶性转化等多种生理、病理过程，该信号通路一旦被异常激活，即会导致细胞增殖，尤其是肿瘤的发生，因此该通路在肿瘤的发生发展中具有重大意义。

Ras是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，Ras基因家族包括H-ras、K-ras和N-ras。酪氨酸激酶受体和G蛋白耦联受体可激活

Ras，Ras是Raf-1 上游信号蛋白，Ras进一步激活Raf/MEK/MAPK信号传导通路。研究表明，Raf激酶家族是Ras的下游信号，Raf激活后与机体的多种肿瘤密切相关〔9〕。若在诱发因素的激活下，则由失活态的Ras-GDP结合构象转变为活化态的Ras-GTP结合构象，引入Raf激酶家族到胞膜并激活Raf启动Ras通路，进而通过关键位点Raf、Mek等激酶依次被磷酸化实现此通路的激活活化。由此推测这可能是胰腺癌细胞增殖的机制之一。

本研究表明5-FU及DG高、低剂量对胰腺癌BxPC-3细胞治疗有效，可以明显减少胰腺癌BxPC-3细胞的存活数目，显示DG对胰腺癌BxPC-3细胞有明显的抑制作用，并且随着DG剂量的增加，治疗效果愈加明显。5-FU及DG高、低剂量对胰腺癌BxPC-3细胞的运动能力有明显的影响，减少了肿瘤细胞的迁移率，减少肿瘤细胞的转移程度，显示DG可以抑制胰腺癌BxPC-3细胞的运动能力。同时，DG高、低剂量对胰腺癌BxPC-3细胞治疗效果明显，伴有剂量效应。透射电镜观察结果也说明DG对胰腺癌BxPC-3细胞的治疗效果较好。而这些效果主要是通过降低Raf-1蛋白的表达来实现的。

综上所述，DG可以通过降低Raf-1的表达来实现对胰腺癌BxPC-3的抑制作用，同时降低运动能力、损伤BxPC-3的形态结构，提示Raf-1蛋白是治疗胰腺癌的靶点蛋白质之一。

4参考文献

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2Li S，Zhu JH，Cao LP，etal.Growth inhibitory in vitro effects of glycyrrhizic acid in U251 glioblastoma cell line〔J〕.Neurol Sci，2014；35(7)：1115-20.

3Ming LJ，Yin AC.Therapeutic effects of glycyrrhizic acid〔J〕.Nat Prod Commun，2013；8(3)：415-8.

4Hou SZ，Li Y，Zhu XL，etal.Ameliorative effects of diammonium glycyrrhizinate on inflammation in focal cerebral ischemic-reperfusion injury〔J〕.Brain Res，2012；1447(1)：20-7.

5Yuan H，Ji WS，Wu KX，etal.Anti-inflammatory effect of Diammonium Glycyrrhizinate in a rat model of ulcerative colitis〔J〕.World J Gastroenterol，2006；12(28)：4578-81.

6段志英.RAF-1和ERK1在胃腺癌中的表达及意义〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(8)：1777-8.

7鞠文博，王大伟，刘岩峰.核心蛋白聚糖对HepG2细胞表皮生长因子受体传导蛋白及Ras /Raf 信号通路的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(6)：1331-3.

8阚秀芳，赵丽晶，李倩，等.人多囊肾囊泡上皮细胞中MAPK 信号通路的调节〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(22)：5630-1.

9Lavoie H，Therrien M.Regulation of RAF protein kinases in ERK signalling〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2015；16(5)：281-98.

〔2015-05-16修回〕

(编辑袁左鸣)

The effects of diammonium glycyrrhizinate on BxPC-3 cell line of pancreatic cancer

ZHANG Ying-Bo，FEI Hong-Xin，ZHONG Li-Li，etal.

Qiqihar Medical University，Qiqihaer 161006，Heilongjiang，China

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of diammonium glycyrrhizinate(DG) on BxPC-3 cell line of pancreatic cancer.MethodsBxPC-3 cell lines of pancreatic cancer were randomly divided into control，5-Fluorouracil(5-FU, 50 μg/ml)，DG high-dose(48 μg/ml)，DG low-dose (24 μg/ml) groups.The MTT was used to determine OD values of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer. The cell scratch was used to determine the exercise capacity of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer. Morphology of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer was observed by optical electron microscopy. The immunohistochemistry and real-time-PCR were applied for detecting rapidly accelerated fibrosarcoma(Raf)-1 levels in BxPC-3 cell line of pancreatic cancer.ResultsCompared with that of control group， OD values of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer in 5-FU，DG high-dose and DG low-dose groups were significantly decreased(P<0.05)，exercise capacity were decreased (P<0.05).Compared with those of control group， BxPC-3 cell line of DG high-dose and medial-dose groups were damaged normal morphological structure，Raf-1 level was significantly decreased(P<0.05).ConclusionsDG plays a certain role in the treatment of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer through inhibiting Raf-1.

【Key words】Diammonium glycyrrhizinate；Pancreatic cancer；Cell line

通讯作者：张晓杰(1965-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事肿瘤、抑郁症、痴呆研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81173576)；黑龙江省教育厅项目(No.12531788，12521624)；黑龙江省博士后资助课题项目(No.LBH-Z14196)

〔中图分类号〕R285

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0523-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.005